Настоящий протокол описывает этапы очистки и последующие исследования четырех различных грибковых β-глюканов в качестве потенциальных иммуномодулирующих молекул, которые усиливают противоопухолевые свойства микроглии против клеток глиобластомы.
Одной из самых больших проблем в разработке эффективных методов лечения глиобластомы является преодоление сильного подавления иммунитета в микроокружении опухоли. Иммунотерапия стала эффективной стратегией, позволяющей обратить реакцию иммунной системы против опухолевых клеток. Глиома-ассоциированные макрофаги и микроглия (ГАМ) являются основными факторами таких противовоспалительных сценариев. Таким образом, усиление противоракового ответа при ГАМ может представлять собой потенциальную коадъювантную терапию для лечения пациентов с глиобластомой. В этом ключе грибковые молекулы β-глюкана давно известны как мощные иммуномодуляторы. Описана их способность стимулировать врожденную иммунную активность и улучшать реакцию на лечение. Эти модулирующие особенности частично объясняются их способностью связываться с рецепторами распознавания образов, которые, что интересно, в значительной степени экспрессируются в GAM. Таким образом, данная работа сосредоточена на выделении, очистке и последующем использовании грибковых β-глюканов для усиления опухолевого ответа микроглии против клеток глиобластомы. Клеточные линии глиобластомы мыши (GL261) и микроглии (BV-2) используются для проверки иммуномодулирующих свойств четырех различных грибковых β-глюканов, извлеченных из грибов, широко используемых в современной биофармацевтической промышленности: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus и Ganoderma lucidum. Для тестирования этих соединений были проведены анализы совместной стимуляции для измерения влияния предварительно активированной среды, кондиционированной микроглией, на пролиферацию и активацию апоптоза в клетках глиобластомы.
Несмотря на появление новых достижений в области нейроонкологии, продолжительность жизни пациентов с глиобластомой остается мизерной. Золотой стандарт лечения опухолей головного мозга основан на сочетании хирургии, лучевой терапии и химиотерапии. Однако в последнее десятилетие иммунотерапия стала мощной стратегией лечения различных видов рака1. Таким образом, возможность использования иммунного ответа организма против опухолевых клеток в последнее время стала четвертым столпом онкологии.
Давно известно, что одной из самых больших проблем в этой области является преодоление сильной иммуносупрессии, обнаруженной в микроокружении опухоли2. В частности, в случае глиобластомы, одной из наиболее распространенных и агрессивных форм рака мозга, раскрытие ключевых путей, которые организуют такие проопухолевые сценарии, и поиск новых соединений, которые могли бы противодействовать угнетающей реакции иммунной системы, может проложить путь для будущих методов лечения этого неизлечимого заболевания.
Мозг обладает собственными клетками иммунной системы, и наиболее подходящим типом клеток являются микроглии. Было доказано, что эти клетки имеют довольно сложное поведение при различных центральных заболеваниях3. В случае первичных опухолей головного мозга (например, глиобластомы) эти клетки смещаются в сторону противовоспалительного фенотипа, который поддерживает опухолевые клетки для колонизации паренхимы головного мозга3. Многочисленные публикации усиливают важную роль этих клеток во время прогрессирования опухоли. Одной из основных причин этого является то, что микроглия, связанная с глиомой, и инфильтрированные макрофаги (ГАМ) составляют одну треть от общей массы опухоли, что позволяет предположить однозначное влияние их активационных состояний при прогрессировании опухоли головного мозга 4,5.
В этом ключе грибковые β-глюканы были описаны как мощные молекулы, вызывающие эффективные иммунные реакции, включая фагоцитоз и выработку провоспалительных факторов, что приводит к элиминации пагубных агентов 6,7,8,9,10. Грибковые β-глюканы, как правило, изучались с использованием экстрактов из различных частей грибов. Однако атрибуция специфических эффектов требует его очистки, чтобы избежать двусмысленностей и иметь возможность понять механизм действия таких молекул, как иммуномодулирующие агенты8.
В этой работе растворимые β-глюканы очищаются от плодового тела четырех различных грибов, регулярно используемых в качестве съедобных (Pleurotus ostreatus и Pleurotus djamor) и лекарственных (Ganoderma lucidum и Hericium erinaceus) грибов. В частности, эти четыре гриба широко используются в пищевой и фармацевтической промышленности и были произведены в рамках экологически чистой экономики замкнутого цикла на коммерческом предприятии (см. Таблицу материалов).
Чтобы заложить основу для будущего использования грибковых β-глюканов в терапии рака мозга, для оценки их потенциальной роли в качестве противоопухолевых медиаторов необходимы четко определенные стратегии очистки и доклинические исследования, посвященные их предполагаемому взаимодействию с клетками иммунной системы. В этой работе описываются многочисленные этапы выделения и очистки, необходимые для извлечения растворимых β-глюканов, содержащихся в плодовых телах выбранного гриба. После успешной очистки клетки микроглии активируются для усиления их воспалительного фенотипа. Клетки глиобластомы мыши (GL261) покрывают другой средой, кондиционированной микроглией, предварительно обработанной этими экстрактами, а затем оценивают ее влияние на поведение опухолевых клеток. Интересно, что пилотные исследования, проведенные в нашей лаборатории (данные не показаны), показали, как провоспалительная микроглия может замедлять миграцию опухолевых клеток и свойства инвазии не только в клетках глиобластомы, но и в других линиях раковых клеток. Эта междисциплинарная работа может стать полезным инструментом для исследователей в области онкологии для тестирования перспективных соединений, способных усиливать иммунный ответ при многих различных типах опухолей.
В этой работе описывается использование хорошо зарекомендовавших себя методов для успешного выделения, очистки и характеристики содержания SβG из четырех различных грибов. Результаты показали, как после экстракции горячей водой SMP, полученных из P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H….
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить доктора Василики Экономопулос за ее собственный сценарий для измерения сигнала фулюоресценции в ImageJ. Мы также хотели бы поблагодарить CITIUS (Университет Севильи) и весь их персонал за поддержку во время демонстрации. Эта работа была поддержана испанским FEDER I + D + i-USE, US-1264152 из Университета Севильи и Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
H2SO4 | |||
HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |