عزل وتنقية β-جلوكان الفطري كاستراتيجية علاج مناعي للورم الأرومي الدبقي
Summary
يصف البروتوكول الحالي خطوات التنقية والدراسات اللاحقة لأربعة أنواع مختلفة من β الجلوكان الفطرية كجزيئات مناعية محتملة تعزز الخصائص المضادة للورم للخلايا الدبقية الصغيرة ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي.
Abstract
أحد أكبر التحديات في تطوير علاجات فعالة ضد الورم الأرومي الدبقي هو التغلب على قمع المناعة القوي داخل البيئة المكروية للورم. برز العلاج المناعي كاستراتيجية فعالة لتحويل استجابة الجهاز المناعي ضد الخلايا السرطانية. تعد الضامة المرتبطة بالورم الدبقي والخلايا الدبقية الصغيرة (GAMs) من الدوافع الرئيسية لمثل هذه السيناريوهات المضادة للالتهابات. لذلك ، قد يمثل تعزيز الاستجابة المضادة للسرطان في GAMs علاجا مساعدا مشتركا محتملا لعلاج مرضى الورم الأرومي الدبقي. في هذا السياق ، تعرف جزيئات β-glucan الفطرية منذ فترة طويلة باسم معدلات المناعة القوية. تم وصف قدرتها على تحفيز النشاط المناعي الفطري وتحسين الاستجابة للعلاج. وتعزى هذه السمات المعدلة جزئيا إلى قدرتها على الارتباط بمستقبلات التعرف على الأنماط ، والتي ، من المثير للاهتمام ، يتم التعبير عنها بشكل كبير في GAMs. وبالتالي ، يركز هذا العمل على عزل وتنقية واستخدام β-glucans الفطرية لتعزيز استجابة مبيدات الأورام للخلايا الدبقية الصغيرة ضد خلايا الورم الأرومي الدبقي. تستخدم خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي للفأر (GL261) والخلايا الدبقية الصغيرة (BV-2) لاختبار الخصائص المناعية لأربعة أنواع مختلفة من β الجلوكان الفطرية المستخرجة من الفطر المستخدم بكثافة في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية الحالية: Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor و Hericium erinaceus و Ganoderma lucidum. لاختبار هذه المركبات ، تم إجراء فحوصات التحفيز المشترك لقياس تأثير وسط مكيف بالخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا على الانتشار وتنشيط موت الخلايا المبرمج في خلايا الورم الأرومي الدبقي.
Introduction
على الرغم من ظهور إنجازات جديدة في مجال الأورام العصبية ، فإن متوسط العمر المتوقع لمرضى الورم الأرومي الدبقي لا يزال ضئيلا. تعتمد العلاجات القياسية الذهبية ضد أورام المخ على دمج الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك ، في العقد الماضي ، ظهر العلاج المناعي كاستراتيجية قوية لعلاج أنواع مختلفة من السرطان1. وهكذا ، أصبحت إمكانية تسخير الاستجابة المناعية للجسم ضد الخلايا السرطانية مؤخرا الركيزة الرابعة لعلم الأورام.
من المعروف منذ فترة طويلة أن أحد أكبر التحديات في هذا المجال هو التغلب على كبت المناعة القوي الموجود داخل البيئة المكروية للورم2. على وجه الخصوص ، في حالة الورم الأرومي الدبقي ، أحد أكثر أشكال سرطان الدماغ شيوعا وعدوانية ، فإن الكشف عن المسارات الرئيسية التي تنظم مثل هذه السيناريوهات المؤيدة للورم وإيجاد مركبات جديدة يمكن أن تتصدى للاستجابة المحبطة للجهاز المناعي قد يمهد الطريق للعلاجات المستقبلية ضد هذا المرض غير القابل للشفاء.
يمتلك الدماغ خلايا الجهاز المناعي الخاصة به ، ونوع الخلايا الأكثر صلة هو الخلايا الدبقية الصغيرة. وقد ثبت أن هذه الخلايا لديها سلوك معقد إلى حد ما عبر الأمراض المركزية المختلفة3. في حالة أورام الدماغ الأولية (على سبيل المثال ، الورم الأرومي الدبقي) ، يتم تحويل هذه الخلايا نحو نمط ظاهري مضاد للالتهابات يدعم الخلايا السرطانية لاستعمار حمة الدماغ3. عززت العديد من المنشورات الدور الرئيسي لهذه الخلايا أثناء تطور الورم. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو أن الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم الدبقي والبلاعم المتسللة (GAMs) تمثل ثلث إجمالي كتلة الورم ، مما يشير إلى التأثير الواضح لحالات تنشيطها أثناء تطور ورم المخ 4,5.
في هذا السياق ، تم وصف β-glucans الفطرية بأنها جزيئات قوية تؤدي إلى استجابات مناعية فعالة ، بما في ذلك البلعمة وإنتاج العوامل المؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى القضاء على العوامل الضارة6،7،8،9،10. تمت دراسة β-glucans الفطرية بشكل عام باستخدام مقتطفات من أجزاء مختلفة من الفطر. ومع ذلك ، فإن إسناد تأثيرات محددة يتطلب تنقيتها لتجنب الغموض والقدرة على فهم آلية عمل هذه الجزيئات مثل العوامل المناعية8.
في هذا العمل ، يتم تنقية β-glucans القابلة للذوبان من الجسم المثمر لأربعة أنواع مختلفة من الفطر ، والتي تستخدم بانتظام كصالحة للأكل (Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor) وكفطر طبي (Ganoderma lucidum و Hericium erinaceus). على وجه الخصوص ، هذه الفطر الأربعة لها استخدام كبير في صناعة الأغذية والأدوية وتم إنتاجها ضمن اقتصاد دائري صديق للبيئة في مؤسسة تجارية (انظر جدول المواد).
من أجل وضع الأساس للاستخدام المستقبلي للجلوكان β الفطرية في علاجات سرطان الدماغ ، فإن استراتيجيات التنقية المحددة جيدا والدراسات قبل السريرية التي تتعمق في تفاعلها المفترض مع خلايا الجهاز المناعي ضرورية لتقييم دورها المحتمل كوسطاء مضادين للورم. يصف هذا العمل الخطوات العديدة للعزل والتنقية اللازمة لاسترداد β-glucans القابلة للذوبان الموجودة داخل الأجسام المثمرة للفطر المختار. بمجرد تنقيتها بنجاح ، يتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز نمطها الظاهري الالتهابي. يتم طلاء خلايا الورم الأرومي الدبقي للفأر (GL261) بوسط مختلف مكيف للخلايا الدبقية الصغيرة ، تمت معالجته مسبقا بهذه المستخلصات ، ثم يتم تقييم تأثيره على سلوك الخلايا السرطانية. ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسات التجريبية من مختبرنا (البيانات غير معروضة) كشفت كيف أن الخلايا الدبقية الصغيرة المؤيدة للالتهابات قد تبطئ هجرة الخلايا السرطانية وخصائص الغزو ليس فقط في خلايا الورم الأرومي الدبقي ولكن أيضا في خطوط الخلايا السرطانية الأخرى. قد يوفر هذا العمل متعدد التخصصات أداة مفيدة للباحثين في علم الأورام لاختبار المركبات الواعدة القادرة على تعزيز الاستجابة المناعية في العديد من أنواع الأورام المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل استخدام التقنيات الراسخة لعزل محتوى SβGs وتنقيته وتوصيف محتوى SβGs بنجاح من أربعة فطريات مختلفة. أظهرت النتائج كيف أنه بعد استخراج الماء الساخن من SMPs ، التي تم الحصول عليها من P. ostreatus و P. djamor و G. lucidum و H. erinaceus ، تليها المعالجة المائية باستخدام α-amylase و glucosidase و pro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتورة فاسيليكي إيكونوموبولوس على نصها الداخلي لقياس إشارة الاستيفاء في ImageJ. نود أيضا أن نشكر CITIUS (جامعة إشبيلية) وجميع موظفيها على دعمهم خلال المظاهرة. تم دعم هذا العمل من قبل FEDER I + D + i-USE الإسبانية ، US-1264152 من جامعة إشبيلية ، ووزارة العلوم ، Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
Riferimenti
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M. Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775 (2021).
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Ricerca sul cancro. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
