Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides de dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal).
Abstract
Las líneas celulares de peces son modelos in vitro prometedores para la evaluación de la ecotoxicidad; sin embargo, los sistemas convencionales de cultivo monocapa (cultivo 2D) tienen limitaciones bien conocidas (por ejemplo, la longevidad del cultivo y el mantenimiento de algunas funciones celulares in vivo ). Así, se han propuesto cultivos 3D, como los esferoides, ya que estos modelos pueden reproducir estructuras similares a tejidos, recapturando mejor las condiciones in vivo . Este artículo describe un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides con dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal). El protocolo consiste en enchapar las celdas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, de fijación ultrabaja. Después de 5 días bajo agitación orbital (70 rpm), se forma un solo esferoide por pocillo. Los esferoides formados presentan tamaño y forma estables, y este método evita la formación de múltiples esferooides en un pozo; Por lo tanto, no es necesario seleccionar esferoides de tamaños similares. La facilidad, velocidad y reproducibilidad de este método esferoide lo hacen útil para pruebas in vitro de alto rendimiento.
Introduction
Los esferoides son pequeñas esferas de células que se forman cuando las células se cultivan en estrecho contacto de célula a célula en cultivo 3D. La capacidad de los esferoides para imitar el entorno tisular in vivo ya ha sido estudiada en una variedad de líneas celulares y células primarias 1,2. Sin embargo, aunque los esferoides están bien desarrollados para estudios de toxicidad en mamíferos, el desarrollo de esferoides para estudios de toxicidad con vertebrados no mamíferos (por ejemplo, peces) todavía está en curso3. Para las líneas celulares de peces, los esferoides se han desarrollado mediante una variedad de métodos diferentes, como la agitación orbital (OS) utilizando diferentes tipos de placas de pozo 3,4,5,6,7, y el método de levitación magnética utilizando nanopartículas magnéticas8. Sin embargo, algunos de estos métodos de cultivo para esferoides pueden tener más desventajas que otros.
Por ejemplo, los métodos giratorios en microplacas grandes (placas de 24 pocillos) pueden generar un gran número de esferoides que difieren en tamaño y forma; De hecho, se ha demostrado la formación de estructuras multiesferoides7. Esto requiere intensos esfuerzos para seleccionar esferoides con un tamaño y forma similares para un experimento. El método de cultivo 3D de gota colgante se utiliza comúnmente para generar esferoides de líneas celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, por lo que se pueden generar esferoides individuales por gota, evitando los problemas descritos anteriormente. Sin embargo, aunque un método modificado de gota colgante (gota colgante + agitación orbital) es capaz de generar esferoides ZFL utilizando un método económico, tiene sus desventajas12. Los agregados celulares formados no pueden mantenerse durante largos períodos en las gotas; Por lo tanto, deben transferirse a placas de pozo. Este proceso requiere una manipulación intensa y largos períodos de trabajo en una campana de flujo laminar, ya que se realiza gota a gota utilizando una micropipeta12. Además, este método requiere 10 días para formar completamente los esferoides ZFL (5 días en gota colgante + 5 días en SG)12. Estas desventajas pueden limitar la aplicación de esferoides de peces 3D para pruebas de toxicidad, especialmente teniendo en cuenta las posibles aplicaciones para la priorización química y la sostenibilidad del producto.
Por lo tanto, este artículo describe un protocolo de cultivo 3D capaz de generar esferoides individuales de líneas celulares ZFL (D. rerio hepatocito normal) y ZEM2S (embrión en fase blastula de D. rerio) basado en el uso combinado de placas de fijación ultra bajas de 96 pocillos (placas ULA) y un agitador orbital (22 mm de diámetro rotacional). El método aplicado es simple y reproducible, y puede generar un gran número de esferoides de tamaño y forma similares en un corto período de tiempo (5 días). Las ventajas de este método pueden apoyar la aplicación de modelos 3D de peces para estudios de toxicidad acuática tanto en la industria como en la academia, así como el progreso de la implementación de métodos alternativos para pruebas de ecotoxicidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este es un método simple, fácil y rápido para generar esferoides de hígado de pez cebra y líneas celulares embrionarias. Este método fue desarrollado por este grupo basado en modificaciones de los métodos de esferoides 3D existentes para superar los problemas reportados en estudios científicos relacionados con la formación de esferoides, así como las incertidumbres en la precisión de los datos de los ensayos de esferoides 3D. Por ejemplo, los problemas reportados radican en las dificultades de manejo, la natur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
Riferimenti
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
