एक संशोधित सैंडविच एलिसा का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप से मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए कॉम्प्लेक्स की मात्रा निर्धारित करना
Summary
हम एक संशोधित सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख तकनीक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि सक्रिय न्यूट्रोफिल से प्राप्त न्यूट्रोफिल बाह्य जाल अवशेषों, मायलोपेरोक्सीडेज संयुग्मित-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस संयुग्मित-डीएनए परिसरों के दो घटकों को मात्रात्मक रूप से मापा जा सके।
Abstract
सूक्ष्मजीवों जैसे कुछ उत्तेजनाएं, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटी) जारी करने का कारण बनती हैं, जो मूल रूप से ग्रेन्युल प्रोटीन के साथ डीएनए से बनी वेब जैसी संरचनाएं हैं, जैसे मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), और साइटोप्लाज्मिक और साइटोस्केलेटल प्रोटीन। यद्यपि हाल ही में एनईटी में रुचि बढ़ी है, नैदानिक सेटिंग्स में एनईटी को मापने के लिए कोई संवेदनशील, विश्वसनीय परख विधि उपलब्ध नहीं है। यह लेख एनईटी, एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के परिसंचारी दो घटकों को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक संशोधित सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख का वर्णन करता है, जो एनईटी के विशिष्ट घटक हैं और एनईटी के ब्रेकडाउन उत्पादों के रूप में बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए जाते हैं। परख एमपीओ या एनई के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कैप्चर एंटीबॉडी और डीएनए-विशिष्ट पहचान एंटीबॉडी के रूप में करती है। एमपीओ या एनई एमपीओ-डीएनए या एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स वाले नमूनों के प्रारंभिक इनक्यूबेशन के दौरान कैप्चर एंटीबॉडी की एक साइट को बांधता है। यह परख अच्छी रैखिकता और उच्च अंतर-परख और इंट्रा-परख परिशुद्धता दिखाती है। हमने कोविड-19 के 16 रोगियों में इसका इस्तेमाल किया और पाया कि एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए की प्लाज्मा सांद्रता स्वस्थ नियंत्रण से प्राप्त प्लाज्मा की तुलना में काफी अधिक थी। यह पहचान परख मानव प्लाज्मा और संस्कृति सुपरनैटेंट में एनईटी की विशेषताओं की जांच के लिए एक विश्वसनीय, अत्यधिक संवेदनशील और उपयोगी विधि है।
Introduction
यह लेख डीएनए 1,2 के साथ मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के परिसरों का पता लगाने के लिए सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके जैविक तरल पदार्थों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (नेट) गठन की मात्रा निर्धारित करने की एक विधि को रेखांकित करता है। एनईटी एक डीएनए रीढ़ से बना होता है जिसे न्यूट्रोफिल ग्रैन्यूल 3,4 से उत्पन्न रोगाणुरोधी प्रोटीज से सजाया जाता है। एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स दोनों एनईटी के महत्वपूर्ण और विशिष्ट घटक हैं और एनईटी 3,4 के ब्रेकडाउन उत्पादों के रूप में बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए जाते हैं।
रोगाणुरोधी रक्षा3 में उनकी महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका के अलावा, एनईटी में विभिन्न रोग प्रभाव4,5 भी हैं, जिनमें थ्रोम्बोजेनेसिस6 को बढ़ावा देना और सेप्सिस7 का बिगड़ना शामिल है। तदनुसार, एनईटी हाल ही में ध्यान आकर्षित कर रहे हैं। फिर भी, एक संवेदनशील, विश्वसनीय मात्रात्मक परख विधि की कमी के कारण एनईटी की विवो मात्रा का ठहराव चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है।
कुछ विधियां उपलब्ध हैं, जिनमें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी8,9 और फ्लो साइटोमेट्री10 द्वारा एनईटी का प्रत्यक्ष माप और परिसंचारी सेल-मुक्त डीएनए, न्यूक्लियोसोम और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 का अप्रत्यक्ष माप शामिल है, लेकिन प्रत्येक विधि के अपने फायदे और सीमाएंहैं। यद्यपि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक विधि एनईटी के लिए विशिष्ट है और स्पष्ट रूप से स्थानीयकरण और नेट गठन की डिग्री दिखाती है, नमूने बायोप्सी ऊतक और स्रावित सामग्री तक सीमित हैं। इसके अलावा, इस विधि को कुशल शोधकर्ताओं द्वारा किया जाना चाहिए और परिणाम प्राप्त करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा नेट से संबंधित घटकों के परिसंचारी स्तर को मापना आसान है और जल्दी से परिणाम प्रदान करता है; हालाँकि, विधि एनईटी12 के लिए विशिष्ट नहीं है।
हम13 और अन्य 1,2 ने एक संशोधित एलिसा तकनीक के साथ मानव प्लाज्मा में परिसंचारी नेट घटकों, एमपीओ-संयुग्मित या एनई-संयुग्मित डीएनए को मापने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और विश्वसनीय परख विकसित की है जो कैप्चर एंटीबॉडी और डीएनए-विशिष्ट पहचान एंटीबॉडी के रूप में एमपीओ या एनई के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इस परख का उपयोग फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) उत्तेजना के जवाब में सक्रिय न्यूट्रोफिल द्वारा जारी सेल कल्चर सुपरनैटेंट में नेट घटकों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एक सैंडविच एलिसा विधि का वर्णन किया है जिसमें एमपीओ-डीएनए या एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स वाले नमूनों के प्रारंभिक इनक्यूबेशन के दौरान एमपीओ या एनई कैप्चर एंटीबॉडी की एक साइट को बांधता है। धोने के बाद, “?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि की समीक्षा में सहायता प्रदान करने के लिए डॉ हक मुहम्मद अमीनुल को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
Riferimenti
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