Qui, presentiamo un protocollo per quantificare il significato fisiologico dell’impatto dell’attività del tessuto adiposo bruno (BAT) sul metabolismo umano. Ciò si ottiene combinando il carico di carboidrati e la calorimetria indiretta con misurazioni dei cambiamenti sopraclavicolari della temperatura. Questo nuovo approccio può aiutare a sviluppare un bersaglio farmacologico per la termogenesi BAT negli esseri umani.
Nei mammiferi, il tessuto adiposo bruno (BAT) viene attivato rapidamente in risposta al freddo per mantenere la temperatura corporea. Sebbene il BAT sia stato ampiamente studiato nei piccoli animali, è difficile misurare l’attività del BAT negli esseri umani. Pertanto, si sa poco sulla capacità di generare calore e sul significato fisiologico delle BAT negli esseri umani, compreso il grado in cui i componenti della dieta possono attivare le BAT. Ciò è dovuto alle limitazioni del metodo attualmente più utilizzato per valutare l’attivazione del glucosio radiomarcato con BAT (fluorodesossiglucosio o 18FDG) misurato mediante tomografia ad emissione di positroni e tomografia computerizzata (PET-CT).
Questo metodo viene solitamente eseguito in soggetti a digiuno, poiché l’alimentazione induce l’assorbimento del glucosio da parte dei muscoli, che può mascherare l’assorbimento del glucosio nel BAT. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per quantificare il dispendio energetico umano totale del corpo e l’utilizzo del substrato dalla termogenesi BAT combinando calorimetria indiretta, termografia a infrarossi e monitoraggio della glicemia nei maschi adulti carichi di carboidrati. Per caratterizzare il significato fisiologico delle BAT, le misure dell’impatto dell’attività delle BAT sulla salute umana sono fondamentali. Dimostriamo un protocollo per raggiungere questo obiettivo combinando il carico di carboidrati e la calorimetria indiretta con misurazioni dei cambiamenti sopraclavicolari della temperatura. Questo nuovo approccio aiuterà a comprendere la fisiologia e la farmacologia della termogenesi delle BAT nell’uomo.
Il tessuto adiposo bruno (BAT) differisce notevolmente dal tessuto adiposo bianco (WAT) nel suo contenuto mitocondriale, innervazione simpatica, goccioline lipidiche multiloculari, capacità di generare calore e distribuzione anatomica. Si è ritenuto che il BAT esistesse solo nei neonati e nei piccoli mammiferi fino alla conferma della sua presenza negli adulti umani nel 2009 1,2,3. Pertanto, fino a tempi relativamente recenti, il ruolo del BAT nella fisiologia umana e nell’omeostasi metabolica è stato poco compreso. Studi approfonditi su piccoli animali hanno dimostrato che durante l’esposizione al freddo, più della metà del metabolismo è dovuto alla capacità termogenica di non rabbrividire di BAT4. Diversi studi hanno dimostrato che in seguito a lieve esposizione al freddo (17-18 °C), l’aumento del dispendio energetico e l’assorbimento di glucosio nel BAT sono fortemente correlati con la termogenesi delle BAT nell’uomo 5,6,7. Inoltre, la termogenesi BAT può contribuire fino al 10% del dispendio energetico a riposo negli esseri umani durante l’esposizione al freddo (per una revisione, vedi Van Schaik et al.8). Lo studio della fisiologia e dell’impatto delle BAT sulla salute e sulla malattia umana è attualmente limitato dalle limitazioni del protocollo. È quindi essenziale disporre di un metodo accurato per misurare il vero impatto metabolico delle BAT per comprendere meglio l’impatto della termogenesi delle BAT sull’obesità e le sue complicanze metaboliche nell’uomo.
La distribuzione anatomica delle BAT umane rende difficile ottenere misurazioni accurate delle BAT. All’interno degli esseri umani, il BAT è distribuito all’interno dei depositi di WAT nell’addome, nel torace e, in particolare, nel collo9. L’autopsia e gli studi cadaverici sono stati utilizzati per caratterizzare anatomicamente il BAT10,11, ma questi metodi non possono fornire informazioni funzionali. È difficile distinguere il BAT utilizzando tecniche di imaging convenzionali a causa delle densità simili di WAT e BAT8. Un ulteriore problema di confusione è che i depositi di grasso beige si trovano anche all’interno degli stessi strati stretti di fascia o in determinati depositi con il WAT8, il che rende difficile distinguere utilizzando le tecniche di imaging convenzionali.
Per ovviare a questo problema, il volume BAT viene tipicamente misurato combinando la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la tomografia computerizzata (CT). L’analogo del glucosio radiomarcato 18 F-fluourodeoxyglucose (18F-FDG) è il tracciante più comune utilizzato per lo studio del BAT 12. Tuttavia, soffre di diverse limitazioni, come esporre i soggetti a radiazioni ionizzanti ed essere invasivo e costoso. Inoltre, la più grande limitazione del tracciante 18F-FDG è che misura l’assorbimento di un analogo del glucosio, che non è l’ideale dato che gli acidi grassi liberi sono i substrati preferiti per la termogenesi BAT13. La tecnica 18F-FDG PET/CT non misura l’assorbimento di acidi grassi liberi come substrato per la termogenesi e, quindi, non misura l’importanza fisiologica della termogenesi delle BAT. Esistono tecniche alternative utilizzate per valutare le BAT umane, che includono la misurazione dell’assorbimento di acqua marcata con ossigeno-15 (15 O-O2) 14,11 C-acetato 15, un acido grasso a catena lunga (acido 18 F-fluoro-6-thia-eptadecanoico)16, o adenosina 17, nonché spettroscopia di risonanza magnetica 18 e risonanza magnetica 19, ma questi sono ancora estremamente costosi ed espongono i soggetti a radiazioni ionizzanti. Pertanto, manca un gold standard affidabile, poco costoso e, soprattutto, sicuro per la quantificazione delle BAT umane.
La termografia a infrarossi (IRT) è una tecnica di imaging alternativa non invasiva20,21 che misura la temperatura della pelle sovrapposta a un deposito BAT noto. Mentre questo implica un aumento del dispendio energetico, se la temperatura misurata non supera la temperatura interna, non è possibile determinare se il cambiamento di temperatura misurato sia semplicemente una conseguenza del flusso sanguigno alterato. Inoltre, un aumento misurato della temperatura locale non fornisce valori di dispendio energetico alterato, che è spesso l’endpoint desiderato. Un certo numero di gruppi di ricerca ha utilizzato IRT per misurare un aumento della temperatura nei depositi di BAT umano a seguito di un intervento di caffeina o stimolo freddo; Questo deposito è la fossa sopraclavicolare 22,23,24,25,26,27.
Tuttavia, non è chiaro se l’azione della caffeina sulla BAT sia diretta o mediata tramite circuiti neurali. Ci sono prove che la caffeina induce caratteristiche di imbrunimento negli adipociti in vitro22, e lavori precedenti hanno dimostrato che la caffeina (100 mg) aumenta la variabilità della frequenza cardiaca, che può essere un indicatore di un aumento del nervo simpatico sistemicamente nel corpo27. Ciò è in linea con l’evidenza nei roditori, in cui la caffeina attraverso il sistema nervoso centrale aumenta la termogenesi senza un impatto cardiodinamico avverso28.
Poiché il substrato preferito per la termogenesi delle BAT sono gli acidi grassi liberi derivati dai trigliceridi13 e i sequestratori attivi di BAT che circolano i lipidi per sostenere la termogenesi29, le misure di utilizzo del substrato sono importanti per valutare l’attivazione fisiologica delle BAT. Il rapporto di scambio respiratorio (RER) è il rapporto tra il volume di ossigeno consumato (V̇O 2) e l’anidride carbonica prodotta (V̇CO2)30. Un RER di 0,7 è indicativo del metabolismo degli acidi grassi e un RER di 1,0 è indicativo del metabolismo dei carboidrati31. Pertanto, l’evidenza di una preferenza per l’utilizzo degli acidi grassi rispetto a un aumento del dispendio energetico è un correlato chiave della termogenesi delle BAT.
Inoltre, dato che l’assorbimento del glucosio è un correlato noto dell’attività BAT (vedi sopra), una caduta della glicemia in parallelo con il cambiamento nell’utilizzo del substrato sono correlati chiave della termogenesi BAT. Studi precedenti che utilizzavano la calorimetria indiretta da sola, o insieme alla registrazione della temperatura in individui a digiuno, hanno riportato poco o nessun cambiamento acuto nell’utilizzo del substrato32,33. Poiché questo è probabilmente mascherato dallo stato di digiuno (dove il metabolismo preassorbitivo favorisce l’utilizzo dei grassi), proponiamo di combinare IRT e calorimetria indiretta con il carico di carboidrati.
Questo articolo mira a fornire un approccio passo-passo che i ricercatori clinici possono utilizzare per quantificare in modo affidabile e, soprattutto, sicuro l’importanza fisiologica del BAT negli esseri umani combinando IRT, calorimetria indiretta e livelli di glucosio nel sangue. Questa tecnica è meglio utilizzata dopo che i soggetti sono stati caricati con carboidrati ed esposti ad agenti BAT farmacologici o stimoli ambientali. I risultati di questo approccio possono essere utilizzati per studiare l’attività delle BAT, l’utilizzo del substrato e il dispendio energetico dopo l’attivazione delle BAT nei singoli soggetti di studio27.
Il metodo che abbiamo mostrato qui è un protocollo tecnicamente semplice, sicuro ed economico per misurare la termogenesi BAT negli esseri umani. Il protocollo affronta le preoccupazioni relative all’affidabilità dell’uso dell’IRT da solo per distinguere tra riscaldamento locale dovuto al flusso sanguigno cutaneo alterato e riscaldamento più profondo dovuto alla termogenesi correlando l’IRT con entrambe le misure del dispendio energetico (EE) e l’utilizzo del substrato. Poiché questa tecnica non utilizza radiazioni ionizzanti, consente l’analisi a misure ripetute, cosa che non è possibile con le tecniche di imaging PET. Infine, mentre le tecniche di imaging PET possono identificare l’attivazione delle BAT, non riportano i risultati fisiologici (aumento della temperatura e EE) che questo protocollo misura.
Il punto di forza del protocollo qui descritto è che ci sono quattro linee di evidenza che supportano la conclusione della termogenesi BAT evocata: (1) aumento del TSCF misurato, in parallelo con la temperatura interna invariata e la temperatura cutanea stabile sulla regione di riferimento adiacente; (2) aumento del dispendio energetico; (3) un cambiamento nell’utilizzo del substrato; e (4) una diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue. Le osservazioni convergenti sono tutte coerenti con i risultati previsti per la termogenesi BAT. La parte essenziale del protocollo è il carico di carboidrati dei partecipanti per garantire il metabolismo dei carboidrati prima dell’intervento. La termogenesi delle BAT commuta il metabolismo del substrato dai carboidrati agli acidi grassi liberi, come dimostrato dalla caduta della RER. Mentre il substrato preferito per la termogenesi BAT sono gli acidi grassi liberi, un assorbimento significativo di glucosio in BAT attivo è ben stabilito 5,6,7. Pertanto, osserviamo un calo dei livelli di glucosio nel sangue in concomitanza con la termogenesi BAT. Non sarebbe possibile osservare il reciproco spostamento nell’utilizzo del substrato (RER) e la caduta dei livelli di glucosio nel sangue a digiuno.
Studi precedenti hanno concluso che l’aumento di Tscf (misurato da IRT) è sufficiente per concludere la termogenesi BAT. Tuttavia, questa conclusione è certa solo se il Tscf supera la temperatura interna. Se il Tscf è inferiore o uguale alla temperatura interna, non può essere escluso un cambiamento locale della temperatura dovuto all’aumento del flusso sanguigno cutaneo. Una revisione sistematica ha concluso che l’IRT da solo non è in grado di determinare se gli aumenti della temperatura cutanea sopraclavicolare siano dovuti alla termogenesi BAT37. La revisione ha rilevato che il metodo più comune (18F-FDG PET/CT) misura l’assorbimento del glucosio nella BAT37. Tuttavia, il substrato preferito per la termogenesi BAT sono gli acidi grassi13. Questo problema metodologico impedisce qualsiasi confronto significativo tra i dati PET/CT nella convalida dei dati IRT, poiché entrambe queste misure da sole non sono una misura adeguata della vera attività metabolica del BAT in quanto non possono indicare il cambiamento nel dispendio energetico e nell’utilizzo del substrato dovuto alla termogenesi delle BAT. Tuttavia, con il protocollo qui descritto, non solo possiamo quantificare il cambiamento di temperatura, ma possiamo anche confermare un aumento del dispendio energetico, un risultato fisiologico chiave della termogenesi BAT. IRT è un metodo senza contatto, non invasivo e relativamente economico per misurare la temperatura e le variazioni di temperatura associate alla termogenesi BAT. Al contrario, la PET-CT è costosa ed espone gli individui alle radiazioni ionizzanti, limitando così l’applicabilità di questo metodo a piccole analisi retrospettive di studi clinici di imaging. L’applicazione dell’attuale protocollo a studi clinici randomizzati su larga scala sarebbe relativamente semplice ed economica.
È importante notare che la diminuzione dell’ossidazione dei carboidrati a seguito dell’intervento sulla caffeina può essere spiegata dal passaggio all’utilizzo del substrato a seguito dell’aumento della termogenesi BAT dovuta all’intervento. Le misure di segnalazione dell’insulina renderebbero i risultati di questo studio più robusti. Tuttavia, non è chiaro sulla base dei risultati di questo studio se la caffeina influenzerebbe la segnalazione dell’insulina attraverso l’azione sulla BAT o se la caduta della glicemia è il risultato del BAT che assorbe più substrati energetici.
Il metodo 18F-FDG PET/CT presenta diverse limitazioni intrinseche quando viene utilizzato per quantificare e misurare l’attività fisiologica delle BAT, in particolare quando si studia l’influenza dei nutrienti o degli ingredienti dietetici sull’attività delle BAT. Il metodo 18F-FDG PET/CT richiede che i soggetti siano a digiuno per evitare aumenti indotti dall’alimentazione nell’assorbimento di glucosio da parte del tessuto muscolare, che possono ridurre significativamente la rilevazione sia della funzione BAT che della funzione BAT38. Inoltre, questa tecnica da sola non può misurare l’impatto fisiologico o l’entità dell’attivazione delle BAT. Inoltre, l’uso di radiazioni ionizzanti negli studi di imaging PET è un ostacolo etico, di salute e sicurezza per la progettazione di studi cross-over a misure ripetute. Inoltre, 18F-FDG rappresenta solo l’assorbimento del glucosio, che non è lo stesso della misurazione del metabolismo del glucosio. Questo metodo di carico di carboidrati soggetti prima di misurare la temperatura BAT e combinare i livelli di glucosio nel sangue con la calorimetria indiretta ci consente di misurare rigorosamente l’impatto fisiologico della termogenesi e dell’utilizzo modificato del substrato, che altrimenti non sarebbe disponibile in uno stato di digiuno.
Punti di forza e limiti
Questo protocollo ha implicazioni più ampie del semplice studio delle BAT. Caricando carboidrati i partecipanti prima dell’intervento, si può osservare l’oscillazione dei livelli di glucosio nel sangue in risposta sia al carico di carboidrati che all’intervento di caffeina, nonché i cambiamenti nell’utilizzo del substrato. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata per migliorare gli studi di calorimetria indiretta umana e le misure metaboliche. Non è ancora noto se i risultati di questo studio possano essere replicati a seguito di altri interventi, come l’esposizione al freddo o la stimolazione adrenergica. Tuttavia, i risultati di questo studio sono stati replicati dopo l’intervento con un diverso ingrediente dietetico, vale a dire Capsicum annuum27. Un ulteriore rigore e fiducia nei risultati potrebbe essere ottenuto utilizzando un approccio in doppio cieco per l’analisi degli interventi utilizzando le tecniche descritte, e questo potrebbe essere facilmente implementato27.
La potenziale confusione della variazione della temperatura ambiente non è rilevante in questo protocollo, poiché la temperatura ambiente è stata mantenuta stabile da partecipante a partecipante. Inoltre, l’umidità è stata presa in considerazione durante la calibrazione dell’analizzatore di gas respiratorio. Questo è dedotto nella configurazione di questo pezzo di attrezzatura, poiché la calibrazione è completata secondo le istruzioni del produttore.
Gli intervalli di tempo per la misurazione e il trattamento sono stati determinati a seguito di un piccolo studio pilota in cui è stata condotta la risoluzione dei problemi del protocollo. In sostanza, gli intervalli di tempo per la misurazione sono stati determinati in base al tempo necessario al ricercatore per eseguire le misurazioni e per il comfort del partecipante. Il tempo per l’intervento è stato determinato in base al tempo impiegato per il metabolismo dei carboidrati dopo il carico di carboidrati per indagare se l’intervento ha aumentato l’ossidazione degli acidi grassi liberi (cioè la termogenesi BAT) e abbassato l’ossidazione dei carboidrati.
In particolare, ci sono differenze tra i livelli di glucosio capillare e venoso39. Tuttavia, nel contesto dell’assistenza extraospedaliera, il modo più comune in cui vengono misurati i livelli di glucosio nel sangue è tramite un campione di sangue di origine capillare analizzato da un glucometro portatile point-of-care40. Inoltre, in individui sani (simili a quelli inclusi in questo protocollo) in un contesto non clinico, esiste una differenza statisticamente significativa, ma non clinicamente significativa, tra i livelli di glucosio nel sangue capillare e venoso quando misurati utilizzando un glucometro a base capillare point-of-care41. In questo contesto, il campionamento capillare rimarrebbe l’approccio ottimale a causa del fatto che la maggior parte dei glucometri point-of-care disponibili sul mercato sono progettati per analizzare campioni di sangue capillare41. Da un punto di vista clinico, si potrebbe sostenere che la glicemia venosa è il metodo superiore di analisi. Tuttavia, il prelievo di sangue venoso non è solo costoso e richiede attrezzature specializzate (ibid), ma è anche invasivo. Le considerazioni etiche sull’aumento del rischio di eventi avversi durante il protocollo devono essere bilanciate con la letteratura riportata che mostra l’elevata correlazione e affidabilità della glicemia capillare come misura proxy della glicemia venosa42. La chiave qui, ovviamente, è che non abbiamo deciso di diagnosticare il diabete, ma di misurare i cambiamenti nei livelli di glucosio nel sangue, per i quali il monitoraggio capillare della glicemia è un protocollo più che adatto.
Il glucosio può indurre la termogenesi e i singoli pasti possono attivare la BAT43. Tuttavia, e piuttosto importante, i dati inclusi in questo manoscritto non mostrano alcun effetto significativo del carico di glucosio nel gruppo di intervento o nel gruppo placebo. Inoltre, i dati inclusi nel manoscritto sono stati ricavati dai risultati di Van Schaik et al., che includevano un terzo intervento (Capsicum annuum), e il carico di glucosio non ha prodotto un effetto significativo sulle misure27.
Va notato che questo protocollo è stato utilizzato solo in partecipanti maschi con basso grasso corporeo e BAT attivo (per ridurre il numero di variabili controllabili, le femmine sono state escluse dallo studio). Esiste una correlazione inversa nota tra adiposità e massa BAT nell’uomo44. Inoltre, è noto che le persone precedentemente obese che hanno perso peso attraverso la dieta e l’esercizio fisico hanno un metabolismo basale più basso e devono consumare diete ipocaloriche per mantenere un peso normale45,46. Inoltre, l’attività delle BAT può stimolare la crescita delle BAT8. Il metodo qui descritto consentirà studi a lungo termine per studiare i cambiamenti nell’attività delle BAT associate a malattie metaboliche in un modo non consentito da altre tecniche.
Conclusione
In conclusione, dimostriamo un approccio di misurazione per quantificare l’attività del tessuto adiposo bruno umano utilizzando IRT e calorimetria indiretta a seguito di un carico di carboidrati. I passaggi critici includono 1) carico di carboidrati ai partecipanti che si trovano in uno stato di digiuno prima di misurare la temperatura del BAT combinando calorimetria indiretta e livelli di glucosio nel sangue per consentire la quantificazione dell’estensione fisiologica della termogenesi BAT e dell’utilizzo alterato del substrato; 2) valutare i depositi di BAT IRT rilevanti e le temperature da un punto di riferimento e da una temperatura interna per dimostrare qualsiasi aumento di Tscf che sarebbe indicativo dell’attivazione di BAT in base alla posizione anatomica. Riteniamo che queste misurazioni quantitative consentano una valutazione più accurata del contributo delle BAT al metabolismo energetico umano adulto e alla termoregolazione. Questo approccio approfondito dovrebbe essere utilizzato dai ricercatori per studiare la fisiologia delle BAT e servire come nuovo standard per lo sviluppo di approcci di attivazione BAT umana in futuro.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare tutti i volontari dello studio per la loro partecipazione al nostro studio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Holsworth Research Initiative, dalla La Trobe University e dal Defence Science Institute (DSI, Australia).
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