Nous présentons ici un protocole pour la sélection in vitro de répresseurs transcriptionnels modifiés (ETR) avec une efficacité de silençage élevée, à long terme, stable et sur cible et une faible activité hors cible à l’échelle du génome. Ce flux de travail permet de réduire un répertoire initial et complexe de RTE candidats à une liste restreinte, adaptée à une évaluation plus approfondie dans des contextes thérapeutiquement pertinents.
L’inactivation génique joue un rôle déterminant dans l’étude de la fonction des gènes et représente une stratégie prometteuse pour le traitement d’un large éventail de maladies. Parmi les technologies traditionnelles, l’interférence de l’ARN souffre de l’abrogation partielle de la cible et de la nécessité de traitements à vie. En revanche, les nucléases artificielles peuvent imposer une inactivation génique stable par induction d’une cassure double brin de l’ADN (DSB), mais des études récentes remettent en question l’innocuité de cette approche. L’édition épigénétique ciblée via des répresseurs transcriptionnels modifiés (ETR) peut représenter une solution, car une seule administration de combinaisons spécifiques d’ETR peut conduire à un silence durable sans induire de cassures de l’ADN.
Les ETR sont des protéines contenant un domaine de liaison à l’ADN programmable (DBD) et des effecteurs de répresseurs transcriptionnels naturels. Plus précisément, il a été démontré qu’une combinaison de trois ETR équipés du domaine KRAB du ZNF10 humain, du domaine catalytique du DNMT3A humain et du DNMT3L humain, induit des états épigénétiques répressifs héréditaires sur le gène cible de l’ETR. La nature aléatoire de cette plate-forme, l’absence d’impact sur la séquence d’ADN de la cible et la possibilité de revenir à l’état répressif par déméthylation de l’ADN à la demande, font du silençage épigénétique un outil qui change la donne. Une étape cruciale est l’identification de la position appropriée des ETR sur le gène cible afin de maximiser la ciblage et de minimiser le silençage hors cible. La réalisation de cette étape dans le cadre préclinique final ex vivo ou in vivo peut s’avérer fastidieuse.
En prenant le système CRISPR/Cas9 en état de mort catalytique comme DBD paradigmatique pour les ETR, cet article décrit un protocole consistant en un criblage in vitro d’ARN guides (ARNg) couplé à la combinaison triple-ETR pour un silençage efficace sur la cible, suivi d’une évaluation du profil de spécificité à l’échelle du génome des meilleurs résultats. Cela permet de réduire le répertoire initial des ARNg candidats à une courte liste d’ARNg prometteurs, dont la complexité est adaptée à leur évaluation finale dans le contexte thérapeutiquement pertinent d’intérêt.
L’inactivation génique a traditionnellement joué un rôle clé dans l’étude de la fonction des gènes dans les modèles cellulaires et animaux. De plus, au cours des deux dernières décennies, avec l’essor de la thérapie génique, elle a été proposée comme une approche potentiellement révolutionnaire pour traiter les maladies causées par des mutations de gain de fonction1, les maladies infectieuses2 ou les pathologies dans lesquelles le silence d’un gène peut compenser un défaut héréditaire dans un autre3. Enfin, l’inactivation génétique des principaux régulateurs de la fitness cellulaire et du contrôle fonctionnel a été proposée pour améliorer l’efficacité des produits cellulaires pour l’immunothérapie du cancer4 et la médecine régénérative5.
Parmi les différentes technologies permettant d’accomplir l’inactivation des gènes, l’une des plus prometteuses est le silençage épigénétique ciblé 6,7. Au cœur de cette technologie se trouvent les répresseurs transcriptionnels modifiés (ETR), des protéines chimériques constituées d’un domaine de liaison à l’ADN programmable (DBD) et d’un domaine effecteur (ED) ayant une fonction répressive épigénétique. Les protéines à doigt de zinc (ZFP)8, les effecteurs de type activateur de transcription (TALE)9 ou les DBD à base de CRISPR/dCas910 peuvent être conçus pour attacher sélectivement la dysfonction érectile à la séquence promoteur/amplificateur du gène cible à réduire au silence. Une fois sur place, l’ED de l’ETR exerce son activité de silençage en imposant des marques épigénétiques répressives induisant l’hétérochromatine telles que les modifications des histones (méthylation H3K9 11,12 ou H3K27 13, désacétylation H3 ou H4 14) et la méthylation de l’ADN CpG 15, selon le domaine répressif utilisé.
En particulier, en s’inspirant des processus moléculaires de répression transcriptionnelle permanente des rétrovirus endogènes survenant dans l’embryonpréimplantatoire 16, une combinaison de trois ETR a été générée pour exploiter les ED suivantes : i) le domaine de la boîte associée à Krüppel (KRAB) du ZNF10 humain ; ii) le domaine catalytique de l’ADN méthyltransférase 3A humaine de novo (DNMT3A) ; et iii) l’ADN méthyltransférase 3-like humain pleine longueur (DNMT3L). KRAB est un domaine répressif conservé partagé par plusieurs ZFPs chez les vertébrés supérieurs17,18, dont l’activité de silençage repose principalement sur sa capacité à recruter KAP1 19-une protéine d’échafaudage qui interagit ensuite avec plusieurs autres inducteurs d’hétérochromatine20-comprenant le complexe de remodelage et de désacétylation des nucléosomes (NuRD) 21, l’histone méthyltransférase H3K9 SETDB122, et le lecteur de méthylation H3K9 HP1 23, 24, entre autres.
DNMT3A transfère activement les groupes méthyle sur l’ADN au niveau des séquences CpG25. L’activité catalytique de DNMT3A est renforcée par son association physique avec DNMT3L, un paralogue de DNMT3A restreint aux cellules embryonnaires et germinales dépourvu du domaine catalytique responsable du transfert du groupe méthyle26,27. La méthylation de l’ADN dans les régions riches en CpG – appelées îlots CpG (CGI) – intégrée dans les éléments promoteurs/amplificateurs des gènes des mammifères est généralement associée au silençage de la transcription28. Il est important de noter qu’une fois déposée, la méthylation de CpG peut être héritée de manière stable tout au long de la mitose par un complexe moléculaire à base d’UHRF1-DNMT129.
La surexpression stable des ETR dans la cellule cible peut être problématique, probablement en raison des risques croissants d’activité hors cible et d’étouffement des interacteurs endogènes de leurs sites cibles physiologiques au fil du temps. Cependant, l’expression transitoire de fractions ETR uniques peut ne pas induire de silençage à long terme avec une efficacité élevée30, ce qui entrave leur application thérapeutique. Par conséquent, une percée majeure dans le domaine a été la preuve que la combinaison des trois ETR basés sur KRAB-, DNMT3A et DNMT3L peut créer une synergie et, même lorsqu’elle n’est co-délivrée que transitoirement, s’imposer sur la séquence promotrice du gène cible H3K9 et la méthylation de CpG. Ceux-ci sont ensuite lus et propagés par la cellule tout au long de la mitose, conduisant à un silençage héréditaire dans de multiples lignées cellulaires humaines et murines, ainsi que dans des cellules primaires cultivées ex vivo 30.
Il convient de noter que le silençage épigénétique imposé par les ETR peut être inversé à la demande par une déméthylation de l’ADN30 ciblée (par exemple, le recrutement de l’ADN déméthylase TET1 à base de CRISPR/dCas9 sur le locus silencieux) ou pharmacologique (administration de l’inhibiteur de l’ADN méthyltransférase 5-Aza), un antidote potentiel en cas d’événements indésirables liés à l’ETR. Des ETR tout-en-un portant les trois EDs à base de KRAB, DNMT3A et DNMT3L ont également été décrits, montrant des efficacités significatives de silençage dans les lignées cellulaires31,32 contre la grande majorité des gènes codant pour des protéines. De plus, plusieurs études utilisant les ETR ont fait état d’un profil d’innocuité élevé, sans activité hors cible majeure en termes de méthylation de novo de CpG ou d’altération de l’accessibilité de la chromatine30,31,32. Cependant, une analyse spécifique du profil de spécificité des ETR équipés d’un DBD nouvellement conçu est recommandée avant les applications cliniques.
D’un point de vue clinique, le silençage épigénétique ciblé peut offrir des avantages essentiels à la fois à l’inhibition basée sur l’interférence de l’ARN (ARNi)33 et à la perturbation génique artificielle basée sur la nucléase8. Contrairement à l’ARNi, le silençage épigénétique ciblé peut induire l’abrogation complète de sa cible par cellule et ne nécessite pas de traitement périodique pour assurer un silence à long terme ; contrairement à la perturbation génétique, elle laisse la séquence d’ADN inaltérée, évitant ainsi la génération de cassures double brin de l’ADN (DSB). Les DSB peuvent alors induire l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire, conduisant potentiellement à une sélection contre les cellules ayant une voie fonctionnelle p5334,35 et, en particulier dans les contextes d’édition de gènes multiplex, à des réarrangements chromosomiques 35. De plus, en relayant le résultat irréversible de la mosaïque irréversible de la réparation de l’ADN DSB médiée par la jonction d’extrémitésnon homologues 36, la perturbation génique ne peut pas éviter la réparation dans le cadre de la cible en séquences codantes fonctionnelles comme l’un des résultats finaux et, contrairement au silençage épigénétique, ne peut pas être effacée à la demande.
Enfin, le silençage épigénétique a le potentiel d’élargir la gamme d’éléments génétiques ciblables à des classes entièrement ou au moins partiellement réfractaires à l’ARNi et à la perturbation des gènes, telles que les éléments régulateurs non transcrits et les ARN non codants30,32. La première étape critique de toute application de silençage épigénétique ciblé consiste à concevoir un panel d’ETR couvrant les différentes séquences régulatrices du gène cible et à identifier les plus performantes. Le nombre d’ETR à tester peut être crucial, compte tenu de la part croissante du génome qui peut être ciblée par les technologies de liaison à l’ADN programmables en cours de développement37. Effectuer le criblage des ETR directement sur le type de cellule dans lequel réduire au silence thérapeutiquement le gène cible représenterait l’option la plus pertinente. Cependant, les cribles à haut débit peuvent être techniquement encombrants dans les cellules primaires en raison de leur survie limitée en culture et de leur capacité d’ingénierie souvent sous-optimale. Les écrans à grande échelle peuvent être encore plus irréalisables in vivo.
Une alternative plus pratique consiste à effectuer un criblage initial d’un large panel d’ETR dans des lignées cellulaires facilement modifiables dans un premier temps, puis à ne valider que les plus prometteuses dans le type de cellule thérapeutiquement pertinent. Une question parallèle est le choix d’une lecture appropriée pour mesurer l’efficacité de l’insonorisation des ETR. L’évaluation directe des niveaux de transcription ou de protéines du gène cible par RT-qPCR, Western Blot ou ELISA peut être coûteuse et prendre beaucoup de temps et peut manquer d’une sensibilité suffisante, limitant ainsi leur application à des échelles à haut débit. La génération de lignées cellulaires rapporteures modifiées ad hoc dans lesquelles un fluorophore est placé sous le contrôle transcriptionnel des séquences régulatrices du gène cible permet d’exploiter l’approche basée sur la cytométrie en flux pour lire le silençage épigénétique au niveau de la cellule unique et à un rythme à haut débit.
À la suite de ces considérations générales, cet article décrit un protocole consistant en un criblage in vitro d’ETR en réseau pour l’efficacité du silençage sur cible, suivi d’une évaluation de l’activité hors cible à l’échelle du génome des meilleurs résultats. Ce flux de travail permet de réduire le répertoire initial des ETR candidats à une courte liste de candidats prometteurs, dont la complexité est adaptée à leur évaluation finale dans le type de cellule d’intérêt thérapeutiquement pertinent.
Parmi les différents DBD programmables qui peuvent être exploités pour générer des ETR, ce protocole se concentrera sur la technologie basée sur CRISPR/dCas9, en raison de la facilité de conception d’ARNg couvrant le promoteur du gène cible à une échelle à haut débit. Cependant, le même flux de travail conceptuel décrit ci-dessous peut être adopté pour évaluer l’efficacité et la spécificité des RTE équipés d’autres DBD.
Le silençage épigénétique ciblé peut représenter une solution prometteuse pour traiter les troubles qui peuvent bénéficier d’une inactivation permanente des gènes, y compris les maladies causées par des mutations de gain de fonction1, les maladies infectieuses2 et les pathologies dans lesquelles le silençage d’un gène peut soit compenser une anomalie héréditairedans un autre 3, soit libérer tout le potentiel des thérapies cellulaires adoptives4, 5. Le En agissant au niveau de la chromatine et en étant auto-propagé par la cellule 7,30,32, le silençage épigénétique peut éviter les altérations toxiques (par exemple, les réarrangements chromosomiques) de la séquence d’ADN du gène cible et le silençage partiel et transitoire de la cible, qui sont des limitations de la perturbation génique artificielle basée sur la nucléase8,34,35 et de l’inhibition basée sur l’ARNi 33, respectivement.
L’une des étapes préliminaires clés de tout protocole de silençage épigénétique consiste à identifier la position appropriée sur le gène cible pour diriger les ETR qui déposeront les marques épigénétiques répressives nécessaires pour désactiver l’activité transcriptionnelle de la cible. Différents éléments régulateurs de départ transcriptionnels, proximaux et distaux peuvent concourir à soutenir la production transcriptionnelle d’un gène humain donné54. De plus, il est désormais possible d’identifier différents sites cibles par élément de régulation spécifique grâce au nombre croissant de technologies programmables de liaison à l’ADN6. Par conséquent, des protocoles, tels que celui décrit ici dans les lignées cellulaires modifiées, peuvent être utilisés pour désigner des sites cibles individuels et/ou des régions génomiques susceptibles d’être réduites au silence épigénétique médié par l’ETR, avant de se lancer dans des efforts d’évaluation fastidieux et chronophages des meilleurs candidats dans le cadre thérapeutique final. Certains aspects critiques du protocole sont décrits plus en détail ci-dessous.
Ingénierie d’une lignée cellulaire rapporteure prédictive de la cible thérapeutique finale
Malgré l’optimisation constante des protocoles d’ingénierie cellulaire – nécessaires ici pour insérer la cassette codant pour le rapporteur fluorescent dans le gène cible et pour délivrer les ETR – on ne peut pas tenir pour acquis qu’ils pourraient déjà être disponibles pour la lignée cellulaire qui ressemble le plus à la cible thérapeutique finale. Dans ce cas, différentes stratégies d’atténuation peuvent être appliquées : a) tirer parti des kits d’optimisation fournis par les fournisseurs pour optimiser en interne le protocole de transfection de la lignée cellulaire cible ; b) le passage à d’autres lignées cellulaires exprimant toujours ce gène cible, mais appartenant à des tissus autres que la cible thérapeutique finale, pour lesquels les protocoles d’ingénierie ont été largement optimisés. Dans le cas où ces options ne sont pas disponibles, on peut envisager de passer à des types de cellules primaires ou à des organoïdes représentant la cible finale. D’une manière générale, tant pour les études précliniques que pour les applications thérapeutiques du silençage épigénétique basé sur l’ETR, les scénarios dans lesquels le gène cible est essentiel pour le type de cellule cible doivent être écartés. L’inhibition complète et à long terme d’un gène essentiel imposé par les ETR conduira à une contre-sélection des cellules cibles au fil du temps (et, potentiellement, à la toxicité du traitement). Dans ces cas, il est préférable d’utiliser d’autres technologies permettant l’abrogation partielle de la cible, comme l’ARNi33.
Évaluation de l’activité de réduction au silence ciblée des ETR
Les ETR basés sur la combinaison des domaines effecteurs KRAB, DNMT3A et DNMT3L se sont avérés efficaces contre la grande majorité des gènes codant pour des protéines, avec une large fenêtre de ciblage permissive d’environ 1 kilobase centrée sur le site de départ de la transcription32. Pour avoir une idée de ce à quoi ressemble une expérience de silençage épigénétique bien réalisée, les détails techniques et les résultats de l’inhibition du gène B2M dans les cellules K-562 sont fournis ici. Cela peut être considéré comme un contrôle positif important à inclure non seulement par les chercheurs travaillant avec des cellules K-562, mais aussi par ceux qui s’approchent de la technologie basée sur l’ETR pour la première fois. Comme indiqué dans le protocole, la perturbation génique basée sur la nucléase artificielle (par exemple, CRISPR/Cas9) est recommandée comme contrôle supplémentaire de l’efficacité de l’administration du gène dans le type cellulaire d’intérêt et du phénotype des cellules privées du gène cible. Après le criblage initial des ARNg à coupler avec les ETR basés sur CRISPR/dCas9, si aucun des ARNg testés n’est capable de faire taire définitivement le gène cible, il faut envisager, dans l’ordre suivant : 1) d’augmenter la quantité d’ARNg et d’ETR délivrés ; 2) tester des pools des meilleurs ARNg à la recherche d’effets synergiques entre eux. Si l’inhibition à long terme n’est toujours pas atteinte, il faut envisager : 3) de tester des ARNg supplémentaires, qui peuvent cibler des sites plus pertinents pour instruire le silençage épigénétique ; 4) le passage à des plates-formes DBD basées sur ZFP8 ou TALE9, qui peuvent avoir une capacité de liaison améliorée à la chromatine cible ; 5) le passage d’un transitoire à un stable, par exemple en intégrant l’expression vectorielle virale des ETR (soit les constructions de fusion de l’ARNg, soit les deux lors de l’adoption de la technologie CRISPR/dCas9). Étant donné que notre groupe a mis au point et possède une solide expérience de la co-livraison des trois ETR distincts30, le protocole et les résultats présentés ici sont basés sur cette approche. Cependant, un flux de travail conceptuel similaire peut probablement être appliqué à un système tout-en-un basé sur CRISPR32.
Évaluation de l’activité hors cible des ETR
De nombreuses études ont montré des indications préliminaires in vitro de la spécificité des ETR basées sur la combinaison des domaines effecteurs KRAB, DNMT3A et DNMT3L30,31,32. Cependant, si parmi les ARNg testés, aucun d’entre eux ne présente un profil de spécificité satisfaisant en termes de régulation transcriptionnelle et/ou de méthylation de novo de l’ADN, on peut poursuivre deux stratégies non mutuellement exclusives : a) réduire le temps de séjour des ETR à l’intérieur de la cellule (et par conséquent leur activité potentielle hors cible) soit en diminuant les doses d’ETR, soit en testant des systèmes d’administration alternatifs. Par exemple, par rapport aux plasmides, on s’attend à ce que l’ARNm et l’administration de protéines réduisent le temps d’exposition des cellules aux ETR et, par conséquent, la probabilité d’une activité hors cible55 ; b) le passage à des variantes Cas9 plus récentes, optimisées pour réduire la liaison hors cible de la plate-forme56, ou à d’autres technologies de liaison à l’ADN basées sur ZFP8 ou TALE9. Il est important de considérer que, par rapport aux échantillons traités simulés, l’activité sur cible et hors cible du silençage génique est affectée non seulement par la liaison de la DBD à leur séquence cible, mais aussi par la capacité potentielle des domaines effecteurs épigénétiques à être recrutés sur d’autres loci par leurs cofacteurs endogènes naturels. Par conséquent, la réduction du temps de séjour des ETR dans la cellule cible peut diminuer non seulement la probabilité de liaison du DBD aux sites hors cible, mais aussi la probabilité que les ETR interagissent avec des cofacteurs endogènes, avec des avantages potentiels en termes de spécificité et des inconvénients en termes d’activité sur cible. Enfin, par rapport aux échantillons traités de manière simulée, certaines des altérations transcriptionnelles et moins probables de la méthylation de CpG mesurées dans les cellules réduites au silence peuvent simplement être dérivées par la privation du gène cible. Ceux-ci ne sont pas considérés comme des cibles hors cible de la technologie de réduction au silence. Pour les identifier, il faut également inclure la perturbation génique par nucléase artificielle dans le panel expérimental 8,9,10. Les altérations biologiques dues à la perte fonctionnelle du gène cible seront partagées entre le silençage épigénétique et cette technologie alternative.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica et Deborah Cipria pour l’effort de collaboration visant à développer la technologie de silençage épigénétique au fil des ans ; Dejan Lazarevic et Francesca Giannese pour l’examen critique des analyses RNA-seq et MeDIP-seq décrites dans le protocole. Ces travaux ont été soutenus par des subventions à A.L. de la Fondation Téléthon (subvention TIGET n° F1) et du programme européen Horizon 2020 (UPGRADE). Les illustrations ont été créées avec BioRender.com.
CONTRIBUTION DES AUTEURS
A.M, M.A.C., F.G. et A.C. ont contribué à la conception du protocole et à la rédaction du manuscrit ; S.V., I.M. et D.C. ont conçu les sections bioinformatiques du protocole et révisé le manuscrit ; A.M. et A.L. ont conçu le protocole, conçu et rédigé le manuscrit avec la participation de tous les auteurs.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |