Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l’isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell’unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell’unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.
I primi progenitori eritroidi sono stati originariamente definiti dal loro potenziale di formazione di colonie in vitro e classificati di “unità” che formano scoppi e colonie note come BFU-e e CFU-e. Fino a poco tempo fa, non erano disponibili metodi per l’isolamento diretto prospettico e completo di progenitori puri di BFU-e e CFU-e da midollo osseo di topo adulto appena isolato. Per colmare questa lacuna, è stato analizzato un set di dati RNA-seq (scRNAseq) a singola cellula del midollo osseo di topo per l’espressione di geni che codificano per i marcatori di superficie cellulare. Questa analisi è stata combinata con saggi sul destino cellulare, consentendo lo sviluppo di un nuovo approccio citometrico a flusso che identifica e consente l’isolamento di sottogruppi completi e puri di progenitori BFU-e e CFU-e nel midollo osseo o nella milza di topo. Questo approccio identifica anche altri sottoinsiemi progenitori, inclusi sottoinsiemi arricchiti per potenziali basofili/mastociti e megacariociti. Il metodo consiste nell’etichettare le cellule fresche del midollo osseo o della milza con anticorpi diretti a Kit e CD55. I progenitori che esprimono entrambi questi marcatori sono quindi suddivisi in cinque popolazioni principali. La popolazione 1 (P1 o CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) contiene tutti i progenitori CFU-e e può essere ulteriormente suddivisa in P1-low (CD71med CD150high) e P1-hi (CD71 high CD150 low), corrispondenti rispettivamente a CFU-e precoce e tardiva; La popolazione 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contiene tutti i progenitori della BFU-e; La popolazione P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) è arricchita per i progenitori basofili/mastociti; La popolazione 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) è arricchita per i progenitori megacariociti; e la popolazione 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41–) contiene progenitori con potenziale eritroide, basofilo/mastocitario e megacariocitico (EBMP) e progenitori multipotenziali (MPP) eritroidi/megacariocitici/basofili. Questo nuovo approccio consente una maggiore precisione nell’analisi dell’eritroide e di altri progenitori ematopoietici e consente anche di fare riferimento alle informazioni sul trascrittoma per ogni popolazione a flusso definita citometricamente.
L’eritropoiesi può essere suddivisa in due fasi principali: eritropoiesi precoce e differenziazione eritroide terminale (Figura 1)1,2,3. Nell’eritropoiesi precoce, le cellule staminali ematopoietiche si impegnano nella linea eritroide e danno origine ai primi progenitori eritroidi, che sono stati identificati per la prima volta nel 1970 sulla base del loro potenziale di formazione di colonie in mezzo semi-solido 4,5,6,7,8,9 . In generale, i progenitori eritroidi sono divisi in due categorie: progenitori precedenti che danno origine ciascuno a un “burst” (un grande aggregato di cluster di cellule eritroidi più piccoli), chiamato “burst-forming unit erythroid” o BFU-e 4,5,6; e la loro progenie, che formano ciascuna un singolo, piccolo gruppo o colonia di cellule eritroidi, chiamato “unità eritroide formante colonie” o CFU-e 7,8,9. BFU-e e CFU-e non esprimono ancora geni eritroidi terminali e non sono morfologicamente riconoscibili. Dopo una serie di divisioni cellulari di auto-rinnovamento o espansione, la CFU-e subisce un passaggio trascrizionale in cui vengono indotti geni eritroidi come le globine, passando così alla differenziazione eritroide terminale (ETD)1,10. Durante l’ETD, gli eritroblasti subiscono da tre a cinque divisioni cellulari di maturazione prima dell’enucleazione per formare reticolociti, che maturano in globuli rossi.
Gli eritroblasti durante la differenziazione terminale sono stati originariamente classificati in base alla loro morfologia in proeritroblasti, basofili, policromatici e ortocromatici. L’avvento della citometria a flusso ha permesso il loro ordinamento prospettico e isolamento in base alle dimensioni delle cellule (misurate mediante forward scatter, FSC) e a due marcatori di superficie cellulare, CD71 e Ter11911,12,13 (Figura 1). Questo e simili approcci citometrici a flusso 14 hanno rivoluzionato lo studio degli aspetti molecolari e cellulari dell’ETD, consentendo l’analisi specifica dello stadio di sviluppo degli eritroblasti in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L’approccio CD71/Ter119 è ora utilizzato di routine nell’analisi dei precursori eritroidi.
Fino a poco tempo fa, un approccio citometrico a flusso simile e accessibile per l’isolamento prospettico diretto e ad alta purezza di CFU-e e BFU-e dal tessuto di topo è sfuggito ai ricercatori. Invece, i ricercatori hanno utilizzato strategie citometriche a flusso che isolano solo una frazione di questi progenitori, spesso in presenza di cellule non eritroidi che co-purificano all’interno degli stessi sottoinsiemi citometrici a flusso21. Di conseguenza, lo studio di BFU-e e CFU-e è stato limitato a sistemi di differenziazione in vitro che derivano e amplificano BFU-e e CFU-e da precedenti progenitori del midollo osseo. E’ quindi possibile applicare strategie citometriche a flusso che distinguono CFU-e da BFU-e in queste colture eritroidi arricchite con progenitori22,23. Un approccio alternativo fa uso di CFU-e fetale e BFU-e, che sono altamente arricchiti nella frazione Ter119-negativa del fegato fetale di topo a metà gestazione 10,24,25. Nessuno di questi approcci, tuttavia, consente lo studio di BFU-e e CFU-e adulti nel loro stato fisiologico in vivo. L’entità della sfida può essere apprezzata quando si ricorda che, sulla base di saggi di formazione di colonie, queste cellule sono presenti nel midollo osseo adulto ad una frequenza di solo 0,025% e 0,3%, rispettivamente6.
Il protocollo qui descritto è un nuovo approccio citometrico a flusso basato sull’analisi trascrittomica a singola cellula di cellule midollari di topo Kit+ appena raccolte (Kit è espresso da tutte le prime popolazioni progenitrici del midollo osseo)1. Il nostro approccio contiene alcuni marcatori di superficie cellulare che erano già in uso da Pronk et al.21,26. I trascrittomi a singola cellula sono stati utilizzati per determinare combinazioni di marcatori di superficie cellulare che identificano eritroidi e altri progenitori ematopoietici precoci (Figura 2). In particolare, la frazione CD55+ delle cellule Kit+ lin-negative può essere suddivisa in cinque popolazioni, tre delle quali producono segmenti contigui della traiettoria eritroide (Figura 2). Le identità trascrittomiche di ciascuna di queste popolazioni sono state confermate mediante ordinamento, seguito da scRNAseq e proiezione dei trascrittomi monocellulari ordinati sulla mappa trascrittomica originale (l’espressione genica in ciascuna delle cinque popolazioni e l’intero set di dati del midollo osseo possono essere esplorati in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Il potenziale di destino cellulare di ciascuna delle popolazioni è stato confermato utilizzando saggi tradizionali di formazione di colonie (Figura 2), nonché un nuovo saggio di destino a singola cellula ad alto rendimento 1,27. Queste analisi mostrano che il nuovo approccio citometrico a flusso si traduce in un isolamento ad alta purezza di tutti i progenitori BFU-e e CFU-e del midollo osseo e della milza adulti freschi. In particolare, la popolazione 1 (P1) contiene solo CFU-e e nessun altro progenitore ematopoietico, e la popolazione 2 (P2) contiene tutti i progenitori BFU-e del midollo osseo e un piccolo numero di CFU-e ma nessun altro progenitore1. Il protocollo dettagliato di seguito è ulteriormente illustrato con un esperimento di esempio in topi a cui è stata iniettata soluzione salina o con l’ormone stimolante l’eritropoiesi (Epo).
La capacità di isolare prospetticamente i progenitori BFU-e e CFU-e direttamente da tessuti freschi con elevata purezza era precedentemente sfuggita ai ricercatori. Il nostro nuovo approccio, convalidato utilizzando scRNAseq e saggi sul destino cellulare 1,27, offre ora gli strumenti per farlo.
Ci sono una serie di punti chiave per eseguire con successo sia i protocolli di ordinamento che quelli analitici. In primo luogo, le cellule d…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |