超分辨率显微镜可以详细了解减数分裂中突触复合物内成分的组织。在这里,我们展示了一种解析 秀丽隐杆线虫 突触复合物的单个蛋白质的方案。
在减数分裂期间,同源染色体必须相互识别并粘附,以允许它们正确分离。确保同源染色体相互作用的关键事件之一是减数分裂前期I中突触复合体(SC)的组装。尽管不同物种之间SC内的蛋白质成分之间几乎没有序列同源性,但SC的总体结构在进化过程中一直高度保守。在电子显微照片中,SC表现为由横向元件或轴,横向细丝和中心元件组成的三方梯状结构。
然而,通过电子显微镜精确识别复合物中单个组分的定位以确定SC的分子结构仍然具有挑战性。相比之下,荧光显微镜可以鉴定复合物中的单个蛋白质成分。然而,由于SC只有~100nm宽,其亚结构无法通过衍射限制的传统荧光显微镜来解析。因此,确定SC的分子结构需要超分辨率光学显微镜技术,例如结构照明显微镜(SIM),受激发射耗尽(STED)显微镜或单分子定位显微镜(SMLM)。
为了保持SC内各个组分的结构和相互作用,重要的是在接近其生殖细胞天然环境的环境中观察复合物。因此,我们展示了一种免疫组织化学和成像方案,该方案能够用SMLM和STED显微镜研究完整的挤出 秀丽隐杆线虫 种系组织中SC的亚结构。将组织直接固定在盖玻片上可减少成像过程中样品的移动,并最大限度地减少样品中的像差,以实现在其生物学环境中可视化SC亚结构所需的高分辨率。
在减数分裂期间将染色体数量减少一半是在有性繁殖生物中产生健康后代的关键。为了实现染色体数量的减少,同源染色体必须在减数分裂I期间配对和分离。为了确保同源染色体的准确分离,生殖细胞经历了延长的前期I,在此期间同源染色体配对,突触和重组以在同源物之间产生物理联系1。SC已成为调节减数分裂前期2正确进展的关键中心结构。
SC是一种复合物,其一般结构在进化上是保守的,即使其蛋白质成分之间几乎没有同源性。SC首先在电子显微照片中被鉴定为由两个横向元件或轴组成的三方梯状结构,一个由横向细丝形成的中心区域和一个中心元件3,4。确定复合体中各个组件的组织是促进我们对SC在减数分裂前期中的作用的理解的关键。
模式生物秀丽隐杆线虫非常适合研究SC的结构和功能,因为它的种系包含大量具有完全组装的SCs5的减数分裂细胞核。遗传和生化研究表明,染色体轴由秀丽隐杆线虫中三种不同的凝聚素复合物6,7 和四种称为 HTP-1/2/3 和 HIM-37,8,9,10,11 的 HORMA 结构域蛋白形成。在SC的中心区域,迄今为止已经鉴定出六种含有线圈结构域的蛋白质12,13,14,15,16,17。为了弥合两个轴之间的距离,SYP-1、-5 和 -6 以头对头的方式二聚化(图 1),而另外三种蛋白质稳定它们在中心元件16,17,18,19 中的相互作用。
详细了解这些蛋白质的组织对于了解SC在减数分裂过程中的许多功能至关重要。由于SC中心区域的宽度仅为~100nm,因此其亚结构无法通过衍射极限荧光显微镜解析。然而,通过超分辨率显微镜很容易实现这种尺寸结构中的组件可视化。事实上,结构照明显微镜(SIM)、扩展显微镜20、受激发射耗尽(STED)显微镜21和单分子定位显微镜(SMLM)22,23已成为研究SC跨物种分子结构的重要工具16,24,25,26,27,28,29,30.
为了克服分辨率限制,STED显微镜依赖于将发射光的衍射极限光斑与STED激光器的甜甜圈形光束叠加,理论上将点扩散函数限制在分子维度31,32。然而,STED在生物样品中实际可以实现的分辨率仍然在 xy33中的几十纳米范围内。
使用SMLM技术可以获得更高的生物样品分辨率。SMLM 利用特定荧光团的闪烁特性,通过及时分离空间重叠的荧光团,在亚衍射水平上分离物体。然后对样品进行重复成像以捕获荧光团的不同子集。然后,通过将点扩散函数(PSF)拟合到所有图像中获得的信号来确定样品中荧光团的位置,这可以解析低至15 nm23,34的结构。
总之,局部图像编码所有荧光团的位置。SMLM的分辨率由荧光团的标记密度和闪烁特性决定。根据奈奎斯特-香农准则,不可能可靠地解析小于平均标签到标签距离两倍的物体。因此,高分辨率成像需要高标记密度。对于 秀丽隐杆线虫中的SC,通过使用基因组编辑连接到内源性蛋白质特定位点的表位标签可以实现高标记密度。然后可以使用具有高亲和力的特异性单克隆抗体对表位标签进行高密度染色19,30。同时,单个荧光基团的循环必须足够短,以确保不会同时捕获空间重叠的荧光团35。
由于这两个要求,解析大分子复合物(如SC)的结构需要对足够多的图像进行成像,因此可能需要几个小时。长成像时间的缺陷是样品由于载物台的移动或样品缓冲液内的小电流而容易漂移;即使是 10 nm 量级的微小运动在 nm 分辨率下也是有害的,必须进行校正。然而,常用的漂移校正方法不够稳健,无法精确叠加顺序成像的两个通道的图像36。这是有问题的,因为生物学问题经常要求精确检测和定位同一样品中的多个靶标。为了规避这些问题,已经开发了比率成像等方法。比率成像允许同时对具有重叠激发和发射光谱的多个荧光团进行成像,随后根据光谱不同通道37,38 中的强度比将每个检测到的信号分配到其各自的荧光团。
此外,研究SC等大分子复合物的组织需要三维(3D)信息。为了实现三维超分辨率(3D-SMLM),在发射光的光路中加入了柱面透镜,该透镜根据荧光团与焦平面的距离扭曲其PSF的形状。因此,可以通过分析其发射信号35,39的形状来推断荧光团在z平面中的精确位置。结合SMLM中的这些进步,可以对包括SC在内的大分子复合物进行3D组织的成像。
SC的梯状组织对于同源染色体的正确重组和分离至关重要,大约70年前在电子显微镜3,4中首次观察到。虽然SC的整体组织在电子显微镜中很容易解决,但该复合物中单个组分的定位需要更有针对性的方法。SC的宽度仅为~100 nm,传统的荧光显微镜无法解析SC的亚结构。然而,超分辨率显微镜已成为突触复合体结构和功能新发现的主要驱动力16,19,24,25,26,27,28,29,30。为了促进这项研究,我们展示了一种安装程序,该程序允许使用SMLM和STED显微镜研究秀丽隐杆线虫性腺组织中SC的结构。
优化SMLM成像分辨率的关键步骤是将种系组织直接交联到聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上(步骤4)。组织与盖玻片的共价附着对于减少样品内的运动至关重要,这些运动会导致较大的漂移,并使SMLM无法长时间成像。此外,即使是次优附着,使含有SC的细胞核与盖玻片保持一定距离,也会导致球差导致可实现的分辨率显着下降(图4)。除了这里使用的共价附着物之外,染色的种系组织也可以固定在一小滴成像缓冲液19,30中的两个密封盖玻片之间。然而,这种固定化方法将样品中成像缓冲液的体积从此处优化方案中使用的1 mL严重减少到仅几μL,这将导致成像缓冲液酸化并严重减少样品成像的时间38,53,54。
SMLM和STED显微镜的采集时间较长,限制了这些方法对化学固定样品的成像。在这里,多聚甲醛固定可确保在样品制备和成像过程中保留SC的结构。然而,尽管这里采取了预防措施来对完整组织中的SC进行成像,但固定后SC的结果结构不一定与活生物体内天然状态下的结构相同。此外,由于固定SC的单个图像代表生物结构的单个“快照”,因此这种方法对 体内天然结构的动力学仍然视而不见。
然而,关于大分子结构的动力学和变异性的信息也可以通过获取不仅仅是单个而是许多“快照”来获得。虽然这种方法可以解决pachytene19期间SC结构的变化,但有几个因素限制了从使用该协议制备的单个样品中获取的图像数量。首先,图像采集过程中使用的高激光功率会导致荧光团永久漂白,并排除了相邻感兴趣区域或多个z平面的成像,从而大大减少了可以从单个样品中获取的图像数量。其次,该方法制备的盖玻片上的样品/组织密度较低,这极大地限制了从单个盖玻片中获取的图像数量。低样本密度也禁止使用有助于阐明其他生物学问题的自动图像采集管道34,55,56,57,58,59。但是,有经验的用户可以稍微增加样品密度。
此处介绍的实验方案经过优化,可获得在 SMLM35 中实现最佳分辨率所需的高标记密度。虽然以前的方案在免疫染色16之前将组织共价附着到盖玻片上,但这种新方案仅在样品在溶液中染色后将组织交联到盖玻片上。这种修饰允许用于免疫标记的抗体从各个侧面自由进入组织,而组织与盖玻片的共价附着可能会限制抗体到达最靠近盖玻片的细胞核,从而降低标记程度。总之,此处描述的修改将分辨率从40-50 nm(FRC分辨率)16 提高到30-40 nm(此协议)。
重要的是,虽然高标记密度和高浓度的抗体对于SMLM至关重要,但我们发现使用较低的抗体浓度可以获得更好的STED显微镜图像(步骤3)。在数十纳米的分辨率下,用于标记目标蛋白质的分子的大小变得越来越重要。因此,我们使用了F(ab’)2片段,其大小是全长抗体的一半。与使用全长二抗相比,由于信号源较小,局部对比度的提高,因此通过这种修改获得的分辨率,允许TauSTED在中心区域内分离SYP-5的两个C末端,这是使用全长抗体(16 和数据未显示)的传统STED无法分离的。我们预计,这种用于完整秀 丽隐杆线虫种系中SC成像的优化方案将有助于研究减数分裂过程中SC的结构 – 功能关系。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Jonas Ries和Ries实验室共享用于SMLM成像的成像缓冲液。我们还要感谢Yumi Kim在本协议中使用的 秀丽隐杆线虫 菌株和Abby F. Dernburg的鸡抗HTP-3抗体。我们感谢海德堡EMBL高级光学显微镜设施的Marko Lampe和Stefan Terjung在使用奥林巴斯iXplore SPIN SR共聚焦显微镜方面的支持。这项工作得到了欧洲分子生物学实验室和德国研究基金会(DFG,德国研究基金会 – 452616889,SK)的支持。我们感谢欧洲分子生物学实验室(EMBL IC)成像中心提供的访问和服务,该中心得到了勃林格殷格翰基金会的慷慨支持。
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |