Vi har tidligere udviklet protokoller for Caenorhabditis elegans til at danne kort- og langsigtede associative minder ved henholdsvis masse- og distanceret træning. Her beskrives detaljerede protokoller til konditionering af C. elegans ved parring af 1-propanol og saltsyre som henholdsvis konditionerede og ubetingede stimuli for at danne aversiv associativ hukommelse.
Nematoden Caenorhabditis elegans er en attraktiv modelorganisme til at studere læring og hukommelse på molekylære og cellulære niveauer på grund af enkelheden i nervesystemet, hvis kemiske og elektriske ledningsdiagrammer blev fuldstændig rekonstrueret fra serielle elektronmikrografer af tynde sektioner. Her beskriver vi detaljerede protokoller for konditionering af C. elegans ved masse- og afstandstræning til dannelse af henholdsvis korttidshukommelse (STM) og langtidshukommelse (LTM). Ved at parre 1-propanol og saltsyre som henholdsvis konditionerede og ubetingede stimuli blev C. elegans med succes uddannet til at danne aversiv associativ STM og LTM. Mens naive dyr blev tiltrukket af 1-propanol, var de trænede dyr ikke længere eller meget svagt tiltrukket af 1-propanol. Ligesom i andre organismer som Aplysia og Drosophila spiller “lærings- og hukommelsesgener” væsentlige roller i hukommelsesdannelse. Især er NMDA-type glutamatreceptorer, udtrykt i kun seks par interneuroner i C. elegans, nødvendige til dannelse af både STM og LTM, muligvis som en tilfældighedsfaktor. Derfor kan hukommelsessporet opholde sig blandt interneuronerne.
Læring og hukommelse er afgørende for, at dyr kan overleve og reproducere sig ved effektivt at navigere i skiftende miljøer. C. elegans er en attraktiv modelorganisme til at studere læring og hukommelse på molekylært og cellulært niveau på grund af enkelheden i dets nervesystem, hvis kemiske og elektriske ledningsdiagrammer blev fuldstændig rekonstrueret fra serielle elektronmikrografer af tynde sektioner 1,2,3.
C. elegans lærer at forbinde dyrkningstemperatur med sult og migrerer væk fra sin væksttemperatur med en aversiv hukommelse, der varer i flere timer 4,5. Konditionering af C. elegans med natriumchlorid (NaCl) i fravær af mad fører til en reduktion i kemotaxis mod NaCl 6,7,8. Når parret med mad, butanon attraktion er forbedret som følge af appetitlig læring 9,10,11. Selvom disse fænomener fortolkes som associativ læring og hukommelse 10,12, er sondringen mellem associativ læring og ikke-associativ sensibilisering, tilvænning og tilpasning ikke klar i C. elegans lærings- og hukommelsesparadigme13,14. Faktisk viste dyr betinget af butanon og fødemangel (aversiv konditionering) deprimeret kobling af butanon sensorisk neuron AWC ON for at målrette neuroner ved hjælp af insulinsignaler fra andre neuroner, herunder AIA-interneuroner, mens dyr betinget med butanon og mad (appetitiv konditionering) viste forbedret kobling af AWCON til målneuroner15 . Insulinsignaleringen forårsager genekspressionsændringer induceret af nuklear EGL-4 og andre transkriptionelle regulatorer16,17. Således har denne aversive og appetitive læring og hukommelse analogier med henholdsvis ikke-associativ tilvænning og sensibilisering af præsynaptiske sensoriske neuroner i gill-tilbagetrækningsrefleksen i Aplysia18,19.
Ved at parre to kemikalier som den konditionerede stimulus (CS) og den ubetingede stimulus (US) har vi og andre udviklet protokoller til konditionering af C. elegans til dannelse af associativ læring og hukommelse uden at bruge mad eller sult som US20,21,22,23. I denne undersøgelse er protokollerne modificeret til at konditionere dyr med 1-propanol og saltsyre (HCI, pH 4.0) som henholdsvis CS og US for aversiv læring og korttidshukommelse (STM) og langtidshukommelse (LTM). Naive C. elegans tiltrækkes af 1-propanol24 og frastødes af syre25. Når de var betinget af en blanding af 1-propanol og HCI (pH 4,0), var C. elegans ikke længere eller meget svagt tiltrukket af 1-propanol.
I denne undersøgelse blev alle reagenser holdt ved en RT på ~ 18 ° C i gennemsnit, og dyr blev dyrket på en bænk ved RT for at undgå stress for dyrene. Desuden blev alle forsøgsprocedurer udført på RT. Dyr blev oprindeligt dyrket i en inkubator ved 20 ° C og derefter konditioneret på en bænk ved ~ 24 ° C ved hjælp af reagenser ved RT. Under disse forhold var resultaterne af konditioneringen meget varierende. Ved den lave RT vokser C. elegans langsomt og bør dyrkes længere end ved 20 °C, indtil dyrene når voksenalderen, da yngre voksne dyr er mere følsomme over for de kemikalier, der anvendes til konditionering, end modne voksne dyr og kan udvise lavere ci-værdier.
Det mest kritiske trin for vellykket konditionering er vask af dyr med ddH2O umiddelbart efter hver kemisk behandling. Derfor bør mekaniske belastninger og temperaturbelastninger minimeres ved hjælp af afsavede pipetspidser, holde reagenser ved RT og meget skånsomt vaske dyrene ved meget langsomt at bevæge dyresamleren op og ned i ddH2O. Grundig vask af dyrene hver gang efter konditionering kan påvirke indlæring og hukommelse. Betingelserne for kemotaxis-analysepladerne påvirker også resultaterne alvorligt. For tørre eller for våde plader forhindrer glat bevægelse af dyrene. Plader blev fremstillet som beskrevet i trin 1.; en god plade er en, for hvilken de 4 μL pletter af ddH2O eller 5% vandig 1-propanol absorberes fuldstændigt af agaren i ca. 5 minutter efter spotting. Som beskrevet ovenfor er dyrenes alder også afgørende for en vellykket konditionering. Unge voksne dyr er følsomme over for mekanisk og kemisk behandling, hvilket resulterer i variable resultater, selvom meget gamle dyr måske heller ikke er egnede til konditionering.
Holdbarheden af 1-propanol afhænger af mærker og partier og er mindre end 3 måneder hos RT. Når CI-værdierne for naive dyr bliver værre, anbefales det at bruge frisk 1-propanol til konditionering og kemotaxis-analyse.
Dannelsen af hukommelse ved massetræning blev ikke påvirket af behandlingen af dyr med oversættelsesinhibitorer (cycloheximid og anisomycin) og en transkriptionsinhæmmer (actinomycin D), mens dannelsen af hukommelse ved den adskilte træning blev markant hæmmet af hæmmerne20,21. Desuden forfaldt førstnævnte hukommelse ved kuldechok, mens sidstnævnte blev bevaret i længere tid end førstnævnte og var modstandsdygtig over for kuldechok. Disse resultater viser, at førstnævnte er STM og sidstnævnte er LTM, henholdsvis20,21. Imidlertid kan hukommelsen dannet af den masserede træning bestå af STM og mellemterm (mellemtid) hukommelse, da STM er svagt afhængig af CREB-transkriptionsfaktoren (figur 5A). Dette er i overensstemmelse med resultatet af, at STM blev bibeholdt i mere end 1 time20,21. Dannelsen af både STM og LTM er stærkt afhængig af nmr-1, som kun udtrykkes i seks par neuroner (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG og PVC) i C. elegans27,28. I disse neuroner kan NMDA-receptorer derfor fungere som en molekylær tilfældighedsdetektor af 1% vandige 1-propanol- og HCl-signaler (pH 4,0) for synaptisk plasticitet, hvor den synaptiske styrke, der kræves for både STM og LTM, kan skyldes tilfældig affyring af præ- og postsynaptiske neuroner 29,30,31,32,33. Derfor kan den aversive associative hukommelse dannes blandt interneuronerne.
De metoder, der er beskrevet i denne undersøgelse, bør kunne anvendes til appetitlig olfaktorisk læring og kortsigtet og langsigtet associativ hukommelse ved hjælp af 1-nonanol som CS og kaliumchlorid som US21. Det er interessant at sammenligne de neuronale kredsløb, der er involveret i dannelsen af appetitive og aversive minder.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang og Hitomi Ohtaki for deres tekniske bistand og kommentarer til manuskriptet. Stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som finansieres af NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.
500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
Incubator | SANYO | MIR-553 | |
Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tooth picks | |||
Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |