Denne protokollen beskriver en metode for disseksjon av musefettdepoter og isolering og fordøyelse av respektive arterier for å frigjøre og deretter identifisere endotelcellepopulasjonen. Ferskt isolerte celler som brukes i nedstrøms applikasjoner vil fremme forståelsen av vaskulær cellebiologi og mekanismene for vaskulær dysfunksjon.
Vaskulære endotelceller som fôrer veggen i det vaskulære systemet spiller viktige roller i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert vaskulær toneregulering, barrierefunksjoner og angiogenese. Endotelcelledysfunksjon er en karakteristisk prediktor og viktig driver for utviklingen av alvorlige kardiovaskulære sykdommer, men de underliggende mekanismene forblir dårlig forstått. Evnen til å isolere og utføre analyser på endotelceller fra ulike vaskulære senger i sin opprinnelige form vil gi innsikt i prosessene ved hjerte- og karsykdommer. Denne protokollen presenterer prosedyren for disseksjon av mus subkutant og mesenterisk fettvev, etterfulgt av isolering av deres respektive arterielle vaskulatur. De isolerte arteriene fordøyes deretter ved hjelp av en spesifikk cocktail av fordøyelsesenzymer fokusert på å frigjøre funksjonelt levedyktige endotelceller. Fordøyd vev vurderes ved flowcytometrianalyse ved bruk av CD31+/CD45−celler som markører for positiv endotelcelleidentifisering. Celler kan sorteres for umiddelbare nedstrøms funksjonelle analyser eller brukes til å generere primære cellelinjer. Teknikken for å isolere og fordøye arterier fra forskjellige vaskulære senger vil gi muligheter for forskere å evaluere nyisolerte vaskulære celler fra arterier av interesse og tillate dem å utføre et bredt spekter av funksjonelle tester på bestemte celletyper.
Endotelceller er godt kjent for sine viktige roller i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert barrierefunksjoner, angiogenese og vaskulær toneregulering 1,2. Selv om endotelcelledysfunksjon er godt dokumentert for å fremme aterosklerose, hypertensjon, diabetes, etc., forblir de underliggende mekanismene som driver endoteldysfunksjon dårlig forstått og sannsynligvis varierer mellom forskjellige vaskulære senger 2,3,4. Forsøket på å avdekke disse patologiske mekanismene for endotelcelledysfunksjon utfordres av den begrensede tilgangen til en ren populasjon av endotelceller fra vev og/eller fenotypiske endringer av endotelceller i kultur 5,6. Derfor vil det å kunne isolere og utføre analyser på endotelceller fra ulike vaskulære senger i sin opprinnelige form gi innsikt i prosessene for hjerte- og karsykdommer.
Denne protokollen presenterer prosedyren for å dissekere subkutant og mesenterisk fettvev fra mus, etterfulgt av isolering av deres respektive arterielle vaskulatur. Funksjonelt levedyktige endotelceller som fôrer arterieveggene frigjøres ved hjelp av en bestemt cocktail av enzymer. Spesiell forsiktighet ble tatt for å optimalisere forholdene i fordøyelsesprotokollen for å oppnå tilstrekkelig utbytte av endotelceller fra <1 mg startvev samtidig som biomolekylære markører ble intakt for analyse. Isolerte endotelceller identifiseres deretter ved hjelp av flowcytometri. Tilstedeværelsen av CD31 (PECAM) brukes til primært å identifisere endotelceller. På grunn av ekspresjonen av CD31 i andre celletyper, inkludert flere av hematopoietisk opprinnelse som også uttrykker CD45, ble renheten til de isolerte endotelcellene ytterligere forbedret ved utelukkelse av celler som uttrykker både CD31 og CD45 5,6,7,8. Videre, avhengig av forskningsspørsmålet og nedstrømsapplikasjonene som skal brukes, bør forskere vurdere å velge et omfattende panel av positive og negative utvalgsmarkører for å optimalisere renheten til cellepopulasjonen av interesse.
Selv om teknikken for å dissekere og isolere fettdepotarterier har blitt brukt i de tidligere publikasjonene 9,10,11,12,13, har en detaljert protokoll som beskriver isolering av innebygde arterier ennå ikke blitt presentert. Å demonstrere teknikken for isolering og fordøyelse av arterier fra forskjellige vaskulære senger fra en gitt art av interesse, vil gi muligheter for forskere å evaluere nyisolerte vaskulære celler fra arterier av interesse og tillate dem å utføre et bredt spekter av funksjonelle tester på bestemte celletyper. Tester kan omfatte, men er ikke begrenset til, flowcytometri for cellesortering og membranproteinuttrykk5,8, elektrofysiologi for ionekanalaktivitet9, molekylær profilering (proteomikk/genomiske analyser etc.) 14,15, og genereringen av primære cellelinjer for narkotikascreening in vitro16,17.
Endoteldysfunksjon er en forløper for alvorlige sykdomstilstander, som sannsynligvis driver utviklingen av aterosklerose, hypertensjon og hjerneslag 3,23. Mens de identifiserte mekanismene som ligger til grunn for endoteldysfunksjon i en gitt patologisk tilstand er mange, vil distinkte vaskulære senger sannsynligvis bli differensielt påvirket av patologiske forhold 4,24. Videre induserer forskjellige kardiovaskulære risikofaktorer (f.eks. fedme, hypertensjon, dyslipidemi, røyking, diabetes) dysfunksjon gjennom en rekke forskjellige mekanismer23,25. Derfor er det avgjørende å isolere endotelcellepopulasjoner fra etablerte dyremodeller av sykdom eller tilgjengelig menneskelig vev og utføre analyser på celler som umiddelbart fjernes fra in vivo-miljøet. Å isolere celler på denne måten har en unik fordel i forhold til å studere celler i kultur ved at de er blottet for kulturinduserte fenotypiske endringer 5,6. Videre, inkludert en heterogen endotelcellepopulasjon, som observert in vivo26,27 (og som kan separeres ytterligere ved hjelp av flytassistert cellesortering), informerer en levende organisme bedre in vivo-miljøet. Endelig er denne metoden anvendelig for undersøkelse av mange dyremodeller og potensielt menneskelig vev og kan brukes til å generere primære cellekulturlinjer, dersom et slikt behov er berettiget.
Det kritiske trinnet i denne protokollen, og det trinnet som vil trenge mest justering for forskjellige vaskulære senger eller celletyper som ikke presenteres her, er fordøyelsen av vaskulært vev. Dette trinnet må optimaliseres for cellehelse uten å redusere celleutbyttet. De spesifikke enzymene som brukes og varigheten for fordøyelsen er avgjørende for å optimalisere cellehelsen og utbyttet for å kunne utføre nedstrøms analyser tilstrekkelig. For identifisering av membranuttrykk av CD36, som påvist ved flowcytometri i subkutane og mesenteriske endotelceller (figur 4), ble det utviklet en modifisert versjon av fordøyelsesprotokollen opprinnelig designet for patch-clamp elektrofysiologi28 . Dette inkluderte en utvidelse av kollagenase I fordøyelsestiden til 30 minutter for å øke celleutbyttet for bedre å møte kravene til flowcytometri vs. det som kreves for patch-clamp studier. Siden denne modifikasjonen til en viss grad kan påvirke cellehelsen, ble det brukt en celle levedyktighetsflekk i flowcytometrianalysene for å sikre at kun levedyktige endotelceller ble vurdert etter denne protokollen (figur 3). Det anbefales at studier som tar sikte på å isolere celler fra vaskulært vev, bør inkludere en markør for cellens levedyktighet før man vurderer ønsket tilnærming.
Den beskrevne protokollen er tilstrekkelig til å frigjøre levedyktige endotelceller for analyse og nedstrøms applikasjoner fra ≤1 mg arterielle prøver avledet fra mus; Men hvis arteriene av interesse skulle isoleres fra forskjellige vev eller organismer (f.eks. Mennesker) som ville resultere i betydelig forskjellige arterielle masser, måtte man optimalisere fordøyelsesenzyminnholdet og varigheten av inkubasjon for effektivt å isolere cellepopulasjonen av interesse. For noen vaskulære senger som begynner med enda mindre mengder startvev enn de subkutane og mesenteriske sengene som presenteres her (f.eks. Koronararteriene), kan det være nødvendig å samle arterier fra flere mus per prøve. Faktisk kan dette være et nødvendig skritt for en gitt vaskulær seng gitt at utfallsmetoden krever et relativt høyt celleutbytte. En stor begrensning er at på grunn av arten av variasjoner per prøvefordøyelse, kan celleutbyttet noen ganger være betydelig forskjellig på tvers av batcher, selv når de er fra samme vaskulære seng. Dette kan forårsake problemer ved analyse av data og bør redegjøres for via normalisering når det er hensiktsmessig. For eksempel var CD36-ekspresjon ekstremt variabelt i rådataene på grunn av endringer i celleutbyttet på tvers av individuelle prøver av subkutane og mesenteriske fettarterier. Rådata ble derfor normalisert til CD31+CD45− gjennomsnittlig fluorescensintensitet med antagelsen om at denne metoden ville korrigere for partiforskjeller (figur 4). Selvfølgelig, avhengig av tilnærmingen, kan det være nødvendig med mer sofistikerte statistiske analyser og normaliseringsmetoder.
Oppsummert presenterer dette papiret en metode for å dissekere, isolere og fordøye subkutane og mesenteriske arterier fra mus for å undersøke uttrykk og / eller funksjon av endotelmål av interesse. Med endringer i den presenterte protokollen kan forskjellige vaskulære senger og celletyper (f.eks. Glatte muskelceller) undersøkes. Denne protokollen, som grunnlag for en mengde tilgjengelige eksperimentelle tilnærminger, har potensial til å fremme forståelsen av vaskulær cellebiologi og mekanismer for vaskulær dysfunksjon.
The authors have nothing to disclose.
Til kjærlig minne om Rich West, en strålende forsker, kollega og kjær venn. Vi vil gjerne takke University of Delaware Flow Cytometry og BioImaging Core som en del av Delaware Biotechnology Institute for deres pågående bidrag til våre studier. Vi vil også takke Emma Hudgins for nøye gjennomgang og redigering av manuskriptet. Vårt arbeid støttes av National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Dette prosjektet ble også støttet av Delaware INBRE-programmet, med tilskudd fra NIGMS (P20GM103446) fra National Institutes of Health og State of Delaware (I.S. Fancher), og et University of Delaware General University Research-stipend (I.S. Fancher). Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis NIHs offisielle synspunkter.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |