Dit protocol beschrijft een methode voor de dissectie van vetdepots van muizen en de isolatie en vertering van de respectieve slagaders om de endotheelcelpopulatie te bevrijden en vervolgens te identificeren. Vers geïsoleerde cellen die worden gebruikt in downstream-toepassingen zullen het begrip van vasculaire celbiologie en de mechanismen van vasculaire disfunctie bevorderen.
Vasculaire endotheelcellen langs de wand van het vasculaire systeem spelen een belangrijke rol in een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder vasculaire tonusregulatie, barrièrefuncties en angiogenese. Endotheelceldisfunctie is een kenmerkende voorspeller en belangrijke drijfveer voor de progressie van ernstige hart- en vaatziekten, maar de onderliggende mechanismen blijven slecht begrepen. Het vermogen om endotheelcellen uit verschillende vaatbedden in hun oorspronkelijke vorm te isoleren en analyses uit te voeren, geeft inzicht in de processen van hart- en vaatziekten. Dit protocol presenteert de procedure voor de dissectie van subcutane en mesenteriale vetweefsels van muizen, gevolgd door isolatie van hun respectieve arteriële vasculatuur. De geïsoleerde slagaders worden vervolgens verteerd met behulp van een specifieke cocktail van spijsverteringsenzymen gericht op het bevrijden van functioneel levensvatbare endotheelcellen. Het verteerde weefsel wordt beoordeeld door middel van flowcytometrie-analyse met behulp van CD31 +/CD45−-cellen als markers voor positieve endotheelcelidentificatie. Cellen kunnen worden gesorteerd voor onmiddellijke downstream functionele assays of worden gebruikt om primaire cellijnen te genereren. De techniek van het isoleren en verteren van slagaders uit verschillende vaatbedden biedt onderzoekers opties om vers geïsoleerde vasculaire cellen uit slagaders van belang te evalueren en hen in staat te stellen een breed scala aan functionele tests op specifieke celtypen uit te voeren.
Endotheelcellen staan bekend om hun belangrijke rol in een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder barrièrefuncties, angiogenese en vasculaire tonusregulatie 1,2. Hoewel endotheelceldisfunctie goed gedocumenteerd is bij het bevorderen van atherosclerose, hypertensie, diabetes, enz., Blijven de onderliggende mechanismen die endotheeldisfunctie veroorzaken slecht begrepen en verschillen ze waarschijnlijk tussen verschillende vaatbedden 2,3,4. De poging om deze pathologische mechanismen van endotheelceldisfunctie te ontrafelen, wordt uitgedaagd door de beperkte toegang tot een zuivere populatie van endotheelcellen uit weefsels en/of de fenotypische veranderingen van endotheelcellen in cultuur 5,6. Daarom zal het kunnen isoleren en uitvoeren van analyses op endotheelcellen uit verschillende vaatbedden in hun oorspronkelijke vorm inzicht geven in de processen van hart- en vaatziekten.
Dit protocol presenteert de procedure om subcutane en mesenteriale vetweefsels van muizen te ontleden, gevolgd door isolatie van hun respectieve arteriële vasculatuur. Functioneel levensvatbare endotheelcellen langs de arteriële wanden worden bevrijd met behulp van een specifieke cocktail van enzymen. Speciale zorg werd besteed aan het optimaliseren van de omstandigheden van het spijsverteringsprotocol om een voldoende opbrengst van endotheelcellen te verkrijgen uit < 1 mg startweefsel, terwijl biomoleculaire markers intact bleven voor analyse. Geïsoleerde endotheelcellen worden vervolgens geïdentificeerd met behulp van flowcytometrie. De aanwezigheid van CD31 (PECAM) wordt voornamelijk gebruikt om endotheelcellen te identificeren. Vanwege de expressie van CD31 in andere celtypen, waaronder verschillende van hematopoietische oorsprong die ook CD45 tot expressie brengen, werd de zuiverheid van de geïsoleerde endotheelcellen verder verbeterd door de uitsluiting van cellen die zowel CD31 als CD45tot expressie brengen 5,6,7,8. Bovendien moeten onderzoekers, afhankelijk van de onderzoeksvraag en de downstream-toepassingen die moeten worden gebruikt, overwegen een uitgebreid panel van positieve en negatieve selectiemarkers te selecteren om de zuiverheid van de interessante celpopulatie te optimaliseren.
Hoewel de techniek van het ontleden en isoleren van vetdepotslagaders is gebruikt in de vorige publicaties 9,10,11,12,13, moet een gedetailleerd protocol dat de isolatie van ingebedde slagaders beschrijft nog worden gepresenteerd. Het demonstreren van de techniek voor de isolatie en vertering van slagaders uit verschillende vasculaire bedden van een bepaalde soort van belang zal onderzoekers opties bieden om vers geïsoleerde vasculaire cellen uit slagaders van belang te evalueren en hen in staat te stellen een breed scala aan functionele tests uit te voeren op specifieke celtypen. Tests kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot flowcytometrie voor celsortering en membraaneiwitexpressie 5,8, elektrofysiologie voor ionkanaalactiviteit9, moleculaire profilering (proteomics / genomische analyses, enz.) 14,15, en de generatie van primaire cellijnen voor geneesmiddelenscreening in vitro 16,17.
Endotheeldisfunctie is een voorloper van ernstige ziektetoestanden, die waarschijnlijk de ontwikkeling van atherosclerose, hypertensie en beroerte stimuleren 3,23. Hoewel de geïdentificeerde mechanismen die ten grondslag liggen aan endotheeldisfunctie in een bepaalde pathologische aandoening talrijk zijn, zullen verschillende vasculaire bedden waarschijnlijk differentieel worden beïnvloed door pathologische aandoeningen 4,24. Bovendien induceren verschillende cardiovasculaire risicofactoren (bijv. Obesitas, hypertensie, dyslipidemie, roken, diabetes) disfunctie via een verscheidenheid aan verschillende mechanismen23,25. Daarom is het van cruciaal belang om endotheelcelpopulaties te isoleren van gevestigde diermodellen van ziekte of toegankelijk menselijk weefsel en testen uit te voeren op cellen die onmiddellijk uit de in vivo omgeving zijn verwijderd. Het op deze manier isoleren van cellen heeft een uniek voordeel ten opzichte van het bestuderen van cellen in cultuur, omdat ze geen cultuur-geïnduceerde fenotypische veranderingen hebben 5,6. Bovendien, het opnemen van een heterogene endotheelcelpopulatie, zoals waargenomen in vivo26,27 (en die verder kan worden gescheiden met behulp van flow-assisted celsortering), van een levend organisme, informeert de in vivo omgeving beter. Ten slotte is deze methode van toepassing op het onderzoek van talrijke diermodellen en mogelijk menselijk weefsel en kan deze worden gebruikt om primaire celkweeklijnen te genereren, indien een dergelijke behoefte gerechtvaardigd is.
De kritieke stap in dit protocol, en de stap die het meest moet worden aangepast voor verschillende vasculaire bedden of celtypen die hier niet worden gepresenteerd, is de vertering van vasculair weefsel. Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor de gezondheid van cellen zonder de celopbrengst te verminderen. De specifieke enzymen die worden gebruikt en de duur van de spijsvertering zijn van cruciaal belang voor het optimaliseren van de celgezondheid en -opbrengst om downstream-testen adequaat te kunnen uitvoeren. Voor de identificatie van membraanexpressie van CD36, zoals gedetecteerd door flowcytometrie in subcutane en mesenteriale endotheelcellen (figuur 4), werd een aangepaste versie van het verteringsprotocol ontwikkeld dat oorspronkelijk was ontworpen voor patch-clamp elektrofysiologie28 . Dit omvatte een verlenging van de collagenase I-verteringstijd tot 30 minuten om de celopbrengst te verhogen om beter te voldoen aan de eisen van flowcytometrie versus wat nodig is voor patch-clamp-studies. Aangezien deze wijziging de gezondheid van de cellen tot op zekere hoogte kan beïnvloeden, werd in de flowcytometrieanalyses een cel levensvatbaarheidskleuring gebruikt om ervoor te zorgen dat alleen levensvatbare endotheelcellen volgens dit protocol werden beoordeeld (figuur 3). Het wordt aanbevolen dat studies gericht op het isoleren van cellen uit vasculair weefsel een marker voor de levensvatbaarheid van cellen bevatten voordat de gewenste aanpak wordt beoordeeld.
Het beschreven protocol is voldoende om levensvatbare endotheelcellen vrij te maken voor analyse en downstream-toepassingen van ≤1 mg arteriële monsters afgeleid van muizen; als de slagaders van belang echter zouden worden geïsoleerd uit verschillende weefsels of organismen (bijv. Mensen) die zouden resulteren in significant verschillende arteriële massa’s, zou men het gehalte aan spijsverteringsenzymen en de duur van de incubatie moeten optimaliseren om de celpopulatie van belang efficiënt te isoleren. Voor sommige vaatbedden die beginnen met nog kleinere hoeveelheden startweefsel dan de hier gepresenteerde subcutane en mesenteriale bedden (bijv. kransslagaders), kan het samenvoegen van slagaders van verschillende muizen per monster nodig zijn. Dit kan inderdaad een noodzakelijke stap zijn voor een bepaald vaatbed, aangezien de uitkomstbenadering een relatief hoge celopbrengst vereist. Een belangrijke beperking is dat, vanwege de aard van variaties per monstervertering, de celopbrengsten soms aanzienlijk kunnen verschillen tussen batches, zelfs wanneer ze uit hetzelfde vaatbed komen. Dit kan problemen veroorzaken bij het analyseren van gegevens en moet indien nodig via normalisatie worden verantwoord. Cd36-expressie was bijvoorbeeld extreem variabel in de ruwe gegevens als gevolg van veranderingen in celopbrengsten in individuele monsters van subcutane en mesenteriale vetslagaders. Daarom werden ruwe gegevens genormaliseerd tot CD31 +CD45− gemiddelde fluorescentie-intensiteit met de veronderstelling dat deze methode zou corrigeren voor batchverschillen (figuur 4). Natuurlijk kunnen, afhankelijk van de aanpak, meer geavanceerde statistische analyses en normalisatiemethoden nodig zijn.
Samenvattend presenteert dit artikel een methode om subcutane en mesenteriale slagaders van muizen te ontleden, isoleren en verteren om de expressie en / of functie van endotheeldoelen van belang te onderzoeken. Met aanpassingen aan het gepresenteerde protocol kunnen verschillende vaatbedden en celtypen (bijvoorbeeld gladde spiercellen) worden onderzocht. Dit protocol, als basis voor een overvloed aan beschikbare experimentele benaderingen, heeft het potentieel om het begrip van vasculaire celbiologie en mechanismen van vasculaire disfunctie te bevorderen.
The authors have nothing to disclose.
In liefdevolle herinnering aan Rich West, een briljante wetenschapper, collega en goede vriend. We willen de University of Delaware Flow Cytometry en BioImaging Core als onderdeel van het Delaware Biotechnology Institute bedanken voor hun voortdurende bijdragen aan onze studies. We willen ook Emma Hudgins bedanken voor de zorgvuldige beoordeling en bewerking van het manuscript. Ons werk wordt ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Dit project werd ook ondersteund door het Delaware INBRE-programma, met een subsidie van de NIGMS (P20GM103446) van de National Institutes of Health en de staat Delaware (I.S. Fancher), en een University of Delaware General University Research grant (I.S. Fancher). Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van NIH.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |