Denne protokol beskriver en metode til dissektion af musefedtdepoter og isolering og fordøjelse af respektive arterier for at frigøre og derefter identificere endotelcellepopulationen. Frisk isolerede celler, der anvendes i downstream-applikationer, vil fremme forståelsen af vaskulær cellebiologi og mekanismerne for vaskulær dysfunktion.
Vaskulære endotelceller, der forer væggen i det vaskulære system, spiller vigtige roller i en række fysiologiske processer, herunder vaskulær toneregulering, barrierefunktioner og angiogenese. Endotelcelledysfunktion er en kendetegnende forudsigelse og vigtig drivkraft for progression af alvorlige hjerte-kar-sygdomme, men de underliggende mekanismer forbliver dårligt forstået. Evnen til at isolere og udføre analyser på endotelceller fra forskellige vaskulære senge i deres oprindelige form vil give indsigt i processerne for hjerte-kar-sygdomme. Denne protokol præsenterer proceduren for dissektion af mus subkutane og mesenteriske fedtvæv efterfulgt af isolering af deres respektive arterielle vaskulatur. De isolerede arterier fordøjes derefter ved hjælp af en specifik cocktail af fordøjelsesenzymer med fokus på at frigøre funktionelt levedygtige endotelceller. Det fordøjede væv vurderes ved flowcytometrianalyse ved hjælp af CD31+/CD45− celler som markører for positiv endotelcelleidentifikation. Celler kan sorteres til øjeblikkelige nedstrøms funktionelle assays eller bruges til at generere primære cellelinjer. Teknikken til at isolere og fordøje arterier fra forskellige vaskulære senge vil give forskere mulighed for at evaluere frisk isolerede vaskulære celler fra arterier af interesse og give dem mulighed for at udføre en bred vifte af funktionelle tests på specifikke celletyper.
Endotelceller er velkendte for deres vigtige roller i en række fysiologiske processer, herunder barrierefunktioner, angiogenese og vaskulær toneregulering 1,2. Selvom endotelcelledysfunktion er veldokumenteret til fremme af aterosklerose, hypertension, diabetes osv., Forbliver de underliggende mekanismer, der driver endoteldysfunktion, dårligt forstået og sandsynligvis adskiller sig mellem forskellige vaskulære senge 2,3,4. Bestræbelserne på at optrævle disse patologiske mekanismer for endotelcelledysfunktion udfordres af den begrænsede adgang til en ren population af endotelceller fra væv og/eller de fænotypiske ændringer af endotelceller i kultur 5,6. Derfor vil det at kunne isolere og udføre analyser på endotelceller fra forskellige karbede i deres oprindelige form give indsigt i processerne for hjerte-kar-sygdomme.
Denne protokol præsenterer proceduren for dissekering af subkutant og mesenterisk fedtvæv fra mus efterfulgt af isolering af deres respektive arterielle vaskulatur. Funktionelt levedygtige endotelceller, der forer arterievæggene, frigøres ved hjælp af en bestemt cocktail af enzymer. Der blev lagt særlig vægt på at optimere betingelserne i fordøjelsesprotokollen for at opnå et tilstrækkeligt udbytte af endotelceller fra <1 mg startvæv, samtidig med at biomolekylære markører blev holdt intakte til analyse. Isolerede endotelceller identificeres derefter ved hjælp af flowcytometri. Tilstedeværelsen af CD31 (PECAM) bruges til primært at identificere endotelceller. På grund af ekspressionen af CD31 i andre celletyper, herunder flere af hæmatopoietisk oprindelse, der også udtrykker CD45, blev renheden af de isolerede endotelceller yderligere forbedret ved udelukkelse af celler, der udtrykker både CD31 og CD45 5,6,7,8. Afhængigt af forskningsspørgsmålet og de downstream-applikationer, der skal anvendes, bør forskere desuden overveje at vælge et omfattende panel af positive og negative selektionsmarkører for at optimere renheden af cellepopulationen af interesse.
Selvom teknikken til dissekering og isolering af fedtdepotarterier er blevet brugt i de tidligere publikationer 9,10,11,12,13, er en detaljeret protokol, der beskriver isoleringen af indlejrede arterier, endnu ikke præsenteret. Demonstration af teknikken til isolering og fordøjelse af arterier fra forskellige vaskulære senge fra en given art af interesse vil give forskere mulighed for at evaluere friskisolerede vaskulære celler fra arterier af interesse og give dem mulighed for at udføre en bred vifte af funktionelle tests på specifikke celletyper. Test kan omfatte, men er ikke begrænset til, flowcytometri til cellesortering og membranproteinekspression5,8, elektrofysiologi for ionkanalaktivitet9, molekylær profilering (proteomics/genomiske analyser osv.) 14,15 og generering af primære cellelinjer til lægemiddelscreening in vitro16,17.
Endotel dysfunktion er en forløber for alvorlige sygdomstilstande, der sandsynligvis driver udviklingen af aterosklerose, hypertension og slagtilfælde 3,23. Mens de identificerede mekanismer, der ligger til grund for endoteldysfunktion i en given patologisk tilstand, er mange, vil forskellige vaskulære senge sandsynligvis blive forskelligt påvirket af patologiske tilstande 4,24. Desuden inducerer forskellige kardiovaskulære risikofaktorer (f.eks. Fedme, hypertension, dyslipidæmi, rygning, diabetes) dysfunktion gennem en række forskellige mekanismer23,25. Derfor er det afgørende at isolere endotelcellepopulationer fra etablerede dyremodeller af sygdom eller tilgængeligt humant væv og udføre assays på celler, der straks fjernes fra in vivo-miljøet. Isolering af celler på denne måde har en unik fordel i forhold til at studere celler i kultur, idet de er uden kulturinducerede fænotypiske ændringer 5,6. Desuden informerer inkludering af en heterogen endotelcellepopulation, som observeret i vivo26,27 (og som kan adskilles yderligere ved hjælp af flowassisteret cellesortering), fra en levende organisme bedre in vivo-miljøet. Endelig kan denne metode anvendes til undersøgelse af adskillige dyremodeller og potentielt humant væv og kan bruges til at generere primære cellekulturlinjer, hvis et sådant behov er berettiget.
Det kritiske trin i denne protokol og det trin, der har mest brug for justering for forskellige vaskulære senge eller celletyper, der ikke præsenteres her, er fordøjelsen af vaskulært væv. Dette trin skal optimeres til cellesundhed uden at mindske celleudbyttet. De specifikke enzymer, der anvendes, og varigheden for fordøjelsen er afgørende for at optimere cellesundhed og udbytte for at kunne udføre nedstrøms assays tilstrækkeligt. Til identifikation af membranekspression af CD36, som detekteret ved flowcytometri i subkutane og mesenteriske endotelceller (figur 4), blev der udviklet en modificeret version af fordøjelsesprotokollen, der oprindeligt var designet til patch-clamp elektrofysiologi28 . Dette omfattede en forlængelse af kollagenasen I fordøjelsestid til 30 minutter for at øge celleudbyttet for bedre at imødekomme kravene til flowcytometri vs. hvad der kræves til patch-clamp-undersøgelser. Da denne ændring til en vis grad kan påvirke cellesundheden, blev der anvendt en cellelevedygtighedsplet i flowcytometrianalyserne for at sikre, at kun levedygtige endotelceller blev vurderet efter denne protokol (figur 3). Det anbefales, at undersøgelser, der har til formål at isolere celler fra vaskulært væv, bør omfatte en markør for cellernes levedygtighed, inden den ønskede fremgangsmåde vurderes.
Den beskrevne protokol er tilstrækkelig til at frigøre levedygtige endotelceller til analyse og downstream-applikationer fra ≤1 mg arterielle prøver afledt af mus; Men hvis arterierne af interesse skulle isoleres fra forskellige væv eller organismer (f.eks. Mennesker), der ville resultere i signifikant forskellige arterielle masser, ville man være nødt til at optimere fordøjelsesenzymindholdet og varigheden af inkubation for effektivt at isolere cellepopulationen af interesse. For nogle vaskulære senge, der begynder med endnu mindre mængder startvæv end de subkutane og mesenteriske senge, der præsenteres her (f.eks. Koronararterier), kan pooling af arterier fra flere mus være nødvendig pr. Prøve. Faktisk kan dette være et nødvendigt skridt for en given vaskulær seng, da resultattilgangen kræver et relativt højt celleudbytte. En væsentlig begrænsning er, at celleudbyttet på grund af arten af variationer pr. prøvefordøjelse undertiden kan være signifikant forskelligt på tværs af batcher, selv når de kommer fra den samme vaskulære seng. Dette kan forårsage problemer ved analyse af data og bør redegøres for via normalisering, når det er relevant. For eksempel var CD36-ekspression ekstremt variabel i rådata på grund af ændringer i celleudbytter på tværs af individuelle prøver af subkutane og mesenteriske fedtarterier. Derfor blev rådata normaliseret til CD31+CD45− gennemsnitlig fluorescensintensitet med den antagelse, at denne metode ville korrigere for batchforskelle (figur 4). Afhængigt af tilgangen kan der naturligvis være behov for mere sofistikerede statistiske analyser og normaliseringsmetoder.
Sammenfattende præsenterer dette papir en metode til at dissekere, isolere og fordøje subkutane og mesenteriske arterier fra mus for at undersøge ekspressionen og / eller funktionen af endotelmål af interesse. Med ændringer af den præsenterede protokol kan forskellige vaskulære senge og celletyper (f.eks. Glatte muskelceller) undersøges. Denne protokol, som et fundament for en overflod af tilgængelige eksperimentelle tilgange, har potentialet til at fremme forståelsen af vaskulær cellebiologi og mekanismer for vaskulær dysfunktion.
The authors have nothing to disclose.
Til kærligt minde om Rich West, en strålende videnskabsmand, kollega og kære ven. Vi vil gerne takke University of Delaware Flow Cytometry og BioImaging Core som en del af Delaware Biotechnology Institute for deres løbende bidrag til vores undersøgelser. Vi vil også gerne takke Emma Hudgins for den omhyggelige gennemgang og redigering af manuskriptet. Vores arbejde støttes af National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Dette projekt blev også støttet af Delaware INBRE-programmet med et tilskud fra NIGMS (P20GM103446) fra National Institutes of Health og staten Delaware (I.S. Fancher) og et University of Delaware General University Research-stipendium (I.S. Fancher). Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis NIH’s officielle synspunkter.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |