Summary

Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

Published: April 11, 2022
doi:

Summary

MALDI-TOF è stato utilizzato per caratterizzare frammenti ottenuti dalla reattività tra RNA ossidato ed esoribonucleasi Xrn-1. Il presente protocollo descrive una metodologia che può essere applicata ad altri processi che coinvolgono RNA e/o DNA.

Abstract

L’RNA è un biopolimero presente in tutti i domini della vita e le sue interazioni con altre molecole e / o specie reattive, ad esempio DNA, proteine, ioni, farmaci e radicali liberi, sono onnipresenti. Di conseguenza, l’RNA subisce varie reazioni che includono la sua scissione, degradazione o modifica, portando a specie biologicamente rilevanti con funzioni e implicazioni distinte. Un esempio è l’ossidazione della guanina a 7,8-diidro-8-ossoguanina (8-oxoG), che può verificarsi in presenza di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Nel complesso, le procedure che caratterizzano tali prodotti e trasformazioni sono in gran parte preziose per la comunità scientifica. A tal fine, la spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è un metodo ampiamente utilizzato. Il presente protocollo descrive come caratterizzare i frammenti di RNA formatisi dopo il trattamento enzimatico. Il modello scelto utilizza una reazione tra l’RNA e l’esoribonucleasi Xrn-1, in cui la digestione enzimatica viene interrotta in siti ossidati. Due sequenze di RNA lungo 20 nucleotidi [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] sono state ottenute tramite sintesi in fase solida, quantificate mediante spettroscopia UV-vis e caratterizzate tramite MALDI-TOF. I fili ottenuti sono stati poi (1) fosforilati 5′ e caratterizzati tramite MALDI-TOF; (2) trattati con Xrn-1; (3) filtrati e dissalati; (4) analizzato tramite MALDI-TOF. Questa configurazione sperimentale ha portato all’identificazione inequivocabile dei frammenti associati allo stallo di Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Gli esperimenti descritti sono stati condotti con 200 picomoli di RNA (20 pmol utilizzati per le analisi MALDI); tuttavia, quantità inferiori possono comportare picchi rilevabili con spettrometri che utilizzano sorgenti laser con più potenza di quella utilizzata in questo lavoro. È importante sottolineare che la metodologia descritta può essere generalizzata e potenzialmente estesa all’identificazione del prodotto per altri processi che coinvolgono RNA e DNA e può aiutare nella caratterizzazione / delucidazione di altri percorsi biochimici.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione e/o la rilevazione di molecole di varie dimensioni e caratteristiche. Alcuni dei suoi usi includono diverse applicazioni come il rilevamento di tannini dalle risorse naturali4, l’imaging di metaboliti negli alimenti5, la scoperta o il monitoraggio di bersagli o marcatori di farmaci cellulari6 e la diagnostica clinica7, per citarne alcuni. Di rilevanza per il presente lavoro è l’uso di MALDI-TOF con DNA o RNA, con il suo uso su oligonucleotidi risalenti a oltre tre decenni8, dove sono state notate diverse limitazioni. Questa tecnica si è ora evoluta in un mezzo affidabile e comunemente usato per caratterizzare entrambi i biopolimeri9 e identificare / comprendere reazioni chimiche e biochimiche, ad esempio, caratterizzazione di siti platinati in RNA10, identificazione di frammenti di RNA a seguito di scissione del filamento 11,12 o formazione di legami incrociati proteina-DNA13 . Pertanto, è utile illustrare ed evidenziare aspetti importanti dell’utilizzo di questa tecnica. Le basi di MALDI-TOF sono state descritte anche in formato video14 e non saranno ulteriormente elaborate nel presente documento. Inoltre, la sua applicazione in un contesto di DNA o proteine è stata precedentemente descritta e illustrata nel suddetto formato 15,16,17.

Il protocollo per la rilevazione di frammenti di RNA formatisi dopo idrolisi enzimatica è riportato qui. Il modello sperimentale è stato scelto sulla base di una recente scoperta pubblicata dal nostro gruppo18, in cui MALDI-TOF è stato utilizzato per determinare la reattività unica tra l’esoribonucleasi Xrn-1 e gli oligonucleotidi dell’RNA contenenti la lesione ossidativa 8-oxoG. I filamenti lunghi a 20 nucleotidi sono stati ottenuti tramite sintesi in fase solida19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mentre Xrn-1 è stato espresso e purificato seguendo il rapporto20 precedentemente descritto. In breve, Xrn-121 è un’esoribonucleasi 5′-3′ con vari ruoli biologici chiave che degradano più tipi di RNA, incluso l’RNAossidato 22. Si è scoperto che la processività dell’enzima si blocca incontrando 8-oxoG, che ha portato a frammenti di RNA contenenti estremità 5′-fosforilate [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Infine, è importante notare che la spettrometria di massa è un metodo potente che, attraverso varie metodologie, può essere adattato ad altri scopi23,24; pertanto, la scelta del giusto metodo di ionizzazione e di altre impostazioni sperimentali è della massima importanza.

Protocol

Per il presente studio è stata utilizzata acqua ultra pura priva di RNasi (Tabella 1). 1. Determinazione della concentrazione della soluzione di RNA Preparare il campione di RNA seguendo i passaggi seguenti. Utilizzare un tubo microcentrifuga (0,6 mL) per preparare una soluzione di RNA diluendo 1 μL di soluzione madre ( ottenuta tramite sintesi in fase solida)19 in 159 μL di H2O privo di RNasi. M…

Representative Results

Gli oligonucleotidi utilizzati in questo lavoro sono stati sintetizzati, caratterizzati e quantificati prima dell’uso. La concentrazione di tutti gli oligonucleotidi è stata determinata tramite spettroscopia UV-vis registrata a 90 °C per evitare letture errate derivanti dalla potenziale formazione delle strutture secondarie. La Figura 3 mostra gli spettri degli oligonucleotidi modello di RNA utilizzati in questo lavoro, presi a temperatura ambiente e dopo l’applicazione di calore….

Discussion

La sfida principale in questo flusso di lavoro è sorta tra la finalizzazione degli esperimenti e l’esecuzione delle analisi spettrometriche di massa. Gli esperimenti sono stati condotti e completati presso l’Università del Colorado a Denver e spediti (durante la notte) alle strutture della Colorado State University. L’acquisizione dei dati è stata effettuata al momento del ricevimento, come da convenienza. Diverse circostanze impreviste hanno portato a ritardi nel processo. In un caso, malfunzionamenti imprevisti dell…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

È importante notare che questo lavoro è stato uno sforzo collaborativo tra tre istituzioni, due gruppi di ricerca e una struttura principale. La distribuzione e il carico di lavoro sono stati effettuati come segue: L’espressione della proteina (Xrn-1) è stata effettuata presso l’Università di Denver (Denver, CO). La sintesi, la quantificazione e la sperimentazione degli oligonucleotidi (principalmente la degradazione enzimatica) sono state condotte presso l’Università del Colorado Denver (Denver, CO). L’ottimizzazione è stata effettuata anche lì. L’individuazione, l’acquisizione e l’analisi di MALDI-TOF sono state effettuate presso l’Analytical Resources Core Facility della Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS desidera riconoscere un urop award (CU Denver) e le sovvenzioni Eureca (CU Denver) per il supporto. E. G.C. riconosce il supporto di NIGMS, tramite R00GM115757. MJER riconosce il supporto di NIGMS, tramite 1R15GM132816. K.B. riconosce l’ID risorsa: SCR_021758. Il lavoro è stato anche sostenuto da un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, dalla Henry Dreyfus Foundation.

Materials

0.6 mL MCT Graduated Violet Fisher Scientific 05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade Fisher Scientific 75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM New Englang Bioscience P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Bruker bacterial test standard Bruker Daltonics 8255343
Commercial source of Xrn-1 New England BioLabs M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Flex analysis software Bruker daltonics FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target Bruker Daltonics 280799
Mass Spectrometer Bruker Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000 Milipore Sigma A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) Pall Corporation OD010C33 filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3 New England Biolabs B7003S This is solution B
Oligo Analyzer tool IDT-DNA https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10 Fisher Scientific 02-707-441
Pipette tips P200 Fisher Scientific 02-707-419
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England BioLabs B0201S This is solution A
Triflouroacetic Acid Alfa Aesar 76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease Expressed in house See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation Millipore ZTC 18S 096 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Schowe, S. W., Langeberg, C. J., Chapman, E. G., Brown, K., Resendiz, M. J. E. Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63720, doi:10.3791/63720 (2022).

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