Summary

מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן

Published: March 01, 2022
doi:

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של מודל קוליטיס דמוי קרוהן במכרסמים. דלקת טרנסמולרית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS, והגדלה מכנית נצפתה במגזר הפרוקסימלי להיצרות. שינויים אלה מאפשרים ללמוד מתח מכני בקוליטיס.

Abstract

מחלות מעי דלקתיות (IBD) כגון מחלת קרוהן (CD) הן הפרעות דלקתיות כרוניות במערכת העיכול המשפיעות על כ -20 לכל 1,000,000 באירופה ובארה”ב. התקליטור מאופיין בדלקת טרנסמורלית, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת. למרות טיפולים אנטי דלקתיים עשויים לעזור לשלוט בדלקת, אין להם יעילות על פיברוזיס והיצרות בתקליטור. הפתוגנזה של התקליטור אינה מובנת היטב. המחקרים הנוכחיים מתמקדים בעיקר בתיחום מנגנוני התגובה החיסונית של המעיים. בעוד שדלקת טרנסמולרית הקשורה לתקליטור, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת מייצגים כולם מתח מכני על דופן המעיים, תפקיד הלחץ המכני בתקליטור אינו מוגדר היטב. כדי לקבוע אם מתח מכני ממלא תפקיד פתוגניים עצמאי בתקליטור, פותח פרוטוקול של מודל קוליטיס דמוי תקליטור המושרה TNBS במכרסמים. מודל זה של דלקת טרנסמורלית ופיברוזיס המושרה על ידי TNBS דומה לסימני היכר פתולוגיים של תקליטור במעי הגס. זה מושרה על ידי החדרה intracolonic של TNBS לתוך המעי הגס הדיסטלי של חולדות ספראג-דולי בוגרות. במודל זה, דלקת טרנסמורלית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS (אתר I). התנערות מכנית נצפתה בחלק הקרוב לאתר ההחדרה (אתר P), המייצג מתח מכני אך לא דלקת גלויה. חלק המעי הגס דיסטלי לדלקת (אתר D) אינו מציג דלקת ולא מתח מכני. שינויים ייחודיים של ביטוי גנים, תגובה חיסונית, פיברוזיס, וצמיחת שרירים חלקה באתרים שונים (P, I, ו- D) נצפו, המדגישים השפעה עמוקה של מתח מכני. לכן, מודל זה של קוליטיס דמוי תקליטור יעזור לנו להבין טוב יותר את המנגנונים הפתוגניים של התקליטור, במיוחד את התפקיד של מתח מכני וביטוי גנים מכני המושרה בלחץ מכני בדיסרגציה חיסונית, פיברוזיס מעיים, ושיפוץ רקמות בתקליטור.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD), מאופיינת בדלקת כרונית במערכת העיכול (GI). זה משפיע על ~ 1-2 מיליון אמריקאים1. העלויות השנתיות המשוערות לטיפול במחלת המעי הרגיז בארה”ב הן 11.8 מיליארד דולר. שלא כמו UC, התקליטור מאופיין על ידי דלקת transmural ו היווצרות קפדנית 2,3. היווצרות קפדנית (היצרות) מתרחשת בעד 70% מחולי CD3 ועשויה להיגרם על ידי דלקת טרנסמורלית (היצרות דלקתית) או פיברוזיס מעיים (היצרות פיברוטית)4,5. פיברוזיס מעיים מאופיין בתצהיר קולגן מוגזם ומטריצות חוץ-תאיות אחרות (ECM) עם תאי שריר חלקים (SMC) כאחד מסוגי התאים המזנכימליים העיקריים המעורבים בתהליך 3,4. היפרפלזיה חלקה של שרירים הקשורים להיפרטרופיה היא שינוי היסטולוגי משמעותי נוסף בהיצרות הפיברוטית ב- CD6. למרות היווצרות קפדנית בתקליטור קשורה עם דלקת כרונית, אין טיפול אנטי דלקתי יעיל, למעט טיפול כירורגי 2,6. עם זאת, הישנות לאחר הניתוח הם כמעט 100%, נתון מספיק זמן 2,7. כתגובה דלקתית, פיברוזיס והיפרפלזיה SMC עלולים להתפתח גם במצבים לא דלקתיים (כלומר, חסימת מעיים) במעיים 8,9; הוא האמין כי הן מנגנונים תלויי דלקת ועצמאיים מעורבים היווצרות קפדנית 3,4. בהתחשב בכך מחקר מקיף לתוך מנגנונים תלויי דלקת לא תורגם לכל טיפול יעיל להיווצרות קפדנית, מחקרים לתוך התפקיד האפשרי של מנגנונים עצמאיים דלקת פיברוזיס מעיים נדרשים.

כגורם לא דלקתי, מתח מכני (MS) הקשורים בצקת, חדירת תאים דלקתיים, עיוות רקמות, פיברוזיס, והיצרות 10,11,12,13 הוא נתקל בדרך כלל IBD, במיוחד CD, אשר מאופיין על ידי דלקת טרנסמורלית. מתח מכני הוא המדהים ביותר בתקליטור רגיש, שבו היצרות (דלקתית או פיברוטית) באתר הדלקת מציגה מתח מכני ברקמה המקומית ומובילה להתנפחות לומן במגזר הפרוקסימלי לאתר החסימה10,14. מחקרים קודמים במבחנה הראו כי מתח מכני משנה ביטוי גנים של מתווכים דלקתיים ספציפיים (כלומר, COX-2, IL-6)8,14,15 וגורמי גדילה (כלומר, TGF-β) ברקמות מערכת העיכול, במיוחד תאי שריר חלקים במעיים (SMC)16. מחקרים אחרונים מצאו גם כי הביטוי של מתווכים פרו-פיברוטיים ספציפיים כגון גורם גדילה רקמת חיבור (CTGF) רגיש מאוד ללחץ מכני17,18. ההשערה הייתה כי מתח מכני עשוי לשחק תפקיד פתוגניים עצמאיים דלקת הקשורים CD, פיברוזיס, ושיפוץ רקמות. עם זאת, המשמעות הפתוגנית של מתח מכני בדלקת מעיים, פיברוזיס והיפרפלזיה חלקה של שרירים בתקליטור נותרה במידה רבה לא נחקרה. זה יכול להיות בחלקו כי דלקת היא תהליך גלוי יותר למד טוב יותר מאשר מתח מכני. חשוב מכך, לא היה מודל בעלי חיים מוגדר היטב של IBD כדי להבחין את ההשפעה של מתח מכני מזה של דלקת.

העבודה הנוכחית מתארת מודל מכרסם של קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הזרקה intracolonic של ריאגנט הפטן 2,4,4,6-trinitrobenzene חומצה גופרתית (TNBS)19,20, אשר עשוי לשמש את המטרה ללמוד את התפקיד של מתח מכני בתקליטור. נמצא כי הטמעת TNBS גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (~ 2 ס”מ באורך) עם לומן היצרות (היצרות) במעי הגס הדיסטלי. היצרות מובילה להתנפחות מעיים מסומנת (מתח מכני)14,15 אך לא דלקת גלויה במגזר המעי הגס בסמיכות לאתר ההחדרה. להיפך, קטע המעי הגס דיסטלי לאתר היצרות מציג לא דלקת ולא מתח מכני. שינויים משמעותיים ספציפיים לאתר בביטוי גנים, דלקת, פיברוזיס, היפרפלזיה SMC נצפו בשלושת האתרים השונים. התוצאות מצביעות על כך שמתח מכני, במיוחד ביטוי גנים מכני המושרה מלחץ, עשוי לשחק תפקיד קריטי בפיתוח פיברוזיס והיפרפלזיה בקוליטיס של קרוהן.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של המחלקה הרפואית של אוניברסיטת טקסס (#0907051C). חולדות ספראג-דולי זכר או נקבה, ~ 8-9 שבועות, שימשו למחקר. 1. הכנת בעלי חיים חולדות מהירות במשך 24 שעות ולטפל בהם עם משלשל (ניקוי מעיים, ראה טב?…

Representative Results

מבט מקרוסקופי על קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הטמעה תוך-קולונית של TNBSכפי שניתן לראות באיור 1, הטמעה תוך-קולונית של TNBS בחולדות גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (באורך של כ-2 ס”מ) עם דופן מעי מעובה ולומן מצומצם (היצרות) באתר ההחדרה במעי הגס הדיסטלי (איור 1A<…

Discussion

קוליטיס הנגרמת על ידי TNBS הוצגה בשנת 1989, שימשה כמודל ניסיוני של מחלת קרוהן מאז 19,20,23. מאפיינים משמעותיים של מודל זה במכרסמים כוללים התפתחות של דלקת טרנסמולרית הדומה מאוד לנגעים ההיסטופתולוגיים שפותחו במחלת קרוהן אנושית19,20</…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מענקים מ- NIH (R01 DK124611 ל- XZS) וממשרד ההגנה האמריקאי (W81XWH-20-1-0681 ל- XZS). עבודת ההיסטולוגיה נעשתה בעזרת המעבדה לפתולוגיה כירורגית UTMB.

Materials

ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers
QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

Riferimenti

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Play Video

Citazione di questo articolo
Geesala, R., Lin, Y., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn’s Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

View Video