Une approche hautement évolutive pour effectuer des études écologiques sur les nématodes de Caenorhabditis Selfing

1. Préparation de la collecte Identifier un endroit pour étudier les nématodes de Caenorhabditis .REMARQUE: Dans la plupart des régions tempérées, C. elegans et C. briggsae peuvent être facilement isolés des habitats associés à l’homme comme les champs agricoles ou les jardins ruraux et urbains1. Dans les régions subtropicales et tropicales, C. briggsae, C. elegans et C. tropicalis peuvent tous être trouvés dans les habitats associés à l’homme énumérés ci-dessus, parfois à proximité les uns des autres. Cependant, C. elegans semble préférer des habitats plus frais et plus secs que les autres espèces dans les habitats tropicaux7,8. Chacune des espèces peut également être isolée des habitats sauvages qui ne sont pas associés à l’homme, mais ces habitats sont échantillonnés moins souvent. Créez un projet Fulcrum pour organiser les données de collecte et d’isolation avec les applications mobiles de collecte de données. Créez un compte avec Fulcrum en ligne à l’aide d’un contrat éducatif gratuit16. Ajoutez l’application Nematode Field Sampling à un compte Fulcrum en cliquant sur le bouton ADD APP17. Ajoutez l’application Nematode Isolation à un compte en cliquant sur le bouton AJOUTER UNE APPLICATION18.REMARQUE: Il est recommandé que chaque voyage à un endroit soit organisé en tant que projet de collecte en utilisant la convention de dénomination « YearMonthLocation », par exemple, 2020FebruaryAustralia. Ajoutez des utilisateurs au compte Fulcrum pour leur accorder l’accès au projet de collection. Assurez-vous que chaque utilisateur télécharge l’application mobile Fulcrum pour participer au projet. Imprimez un ensemble d’étiquettes QR-code pour suivre les collections (C-labels) et les isolations de nématodes (S-labels) avec l’application mobile. Fixez les étiquettes C aux sacs en plastique à fermeture à glissière, roulez les sacs étiquetés en groupes de 25 et enveloppez-les d’un élastique pour l’emballage. Conservez l’ensemble des étiquettes S pour une utilisation en laboratoire.REMARQUE: Tout au long de ce protocole, les collections (substrats du terrain) sont contenues dans des sacs ou sur des assiettes et sont étiquetées avec des étiquettes C. Les nématodes isolés sont étiquetés avec des étiquettes S. Les étiquettes C sont utilisées pour identifier des collections uniques, et les étiquettes S sont utilisées pour identifier des isolats de nématodes uniques. Ces deux types d’étiquettes sont utilisés pour établir la connexion entre une collection particulière (C-label) et les nématodes isolés de cette collection (S-labels) dans la base de données Fulcrum. Imprimez deux fois plus d’étiquettes S en tant qu’étiquettes C pour un projet de collection car, en moyenne, deux nématodes sont isolés par collection. Plus d’étiquettes S peuvent être imprimées plus tard si nécessaire. 2 500 étiquettes C uniques (dossier supplémentaire 1) et 5 000 étiquettes S uniques (dossier supplémentaire 2) sont fournies dans le supplément. Préparez des plaques NGMA de 10 cm pour les collections et des plaques NGMA de 3,5 cm pour isoler les nématodes. Faire une assiette de 10 cm et au moins deux assiettes de 3,5 cm par collection21. Ces plaques sont ensemencées avec la souche OP50 d’Escherichia coli selon les protocoles établis. Conserver les plaques avant utilisation à 4 °C pendant 1 mois au maximum. 2. Collecte sur le terrain REMARQUE: Les nématodes Caenorhabditis sont le plus souvent isolés à partir de matières végétales en décomposition, y compris les fruits, les noix, les graines, les gousses, les fleurs, les tiges, la litière végétale et le compost1,5,6,8. Les meilleurs substrats sont pourris et presque méconnaissables comme des fruits ou des fleurs; éviter les substrats trop secs ou humides (Figure 1). Les substrats sont collectés plus efficacement sur le terrain en travaillant par paires. La personne avec le thermomètre infrarouge sans contact sélectionnera un substrat pour le prélèvement et prélèvera l’échantillon tandis que son partenaire utilisera l’application d’échantillonnage sur le terrain des nématodes dans Fulcrum pour enregistrer les données de collecte. La paire de collecteurs répétera ce processus jusqu’à ce que le nombre souhaité d’échantillons soit collecté. La liste des documents requis pour le travail sur le terrain se trouve dans (Tableau supplémentaire 1). Ouvrez l’application mobile Fulcrum, sélectionnez Nematode Field Sampling dans le menu déroulant. Appuyez sur + pour démarrer un nouvel enregistrement dans le projet (Figure 2A). Prenez une photo du substrat. Cliquez sur la case en haut au centre pour sélectionner le bon projet de collection réalisé à l’étape 1.2 (Figure 2B). Appuyez sur le champ C-label au bas de l’enregistrement de collection et choisissez Numériser lorsque l’invite apparaît. Scannez le code-barres sur le sac de collecte à l’aide de l’appareil photo de l’appareil mobile, puis appuyez sur Terminé en haut à droite de l’écran. Appuyez sur le champ Substrat et sélectionnez un type de substrat dans le menu déroulant. Ajoutez des notes sur le substrat en appuyant sur le champ Notes de substrat et en saisissant manuellement des notes. Choisissez un paysage dans le menu déroulant. Choisissez le paysage qui représente le mieux le site d’échantillonnage. Choisissez une vue du ciel. Lorsque vous choisissez une vue du ciel, décrivez la visibilité du ciel sur le site d’échantillonnage (p. ex., Une vue plein ciel sans vue obstruée depuis les arbres ou d’autres structures = pleine). Mesurez la température de surface du substrat à l’aide du thermomètre sans contact et enregistrez la valeur dans le champ de température du substrat.REMARQUE: Tenez le thermomètre sans contact à moins de 14 pouces du substrat pendant l’enregistrement de la température. Mesurez la température et l’humidité ambiantes avec l’appareil portable et enregistrez ces données dans les champs appropriés.REMARQUE: Vérifiez que le dispositif de température et d’humidité ambiantes n’est pas en attente. L’unité de mesure changera lorsque le bouton sera relâché. Gardez l’appareil dans une poche extérieure pour éviter les lectures irrégulières. Enregistrez l’enregistrement dans Fulcrum en appuyant sur Enregistrer en haut à gauche de l’écran. Collectez environ une cuillère à soupe du substrat sans bâtons ni autres pièces dures en inversant le sac de collecte pour l’utiliser comme « gant » pour ramasser le substrat, puis scellez le sac. Mettez une serviette en papier dans le sac si l’échantillon est particulièrement humide.REMARQUE: Dans les climats chauds, placez les sacs dans des glacières souples avec des emballages plus frais pour garder les collections au frais. Une fois que tous les échantillons ont été prélevés pour la journée, nettoyez l’équipement de collecte, retirez les batteries des sondes, rechargez les batteries, recongelez les packs de congélation. Synchronisez les données de collecte de Fulcrum en appuyant sur le bouton Synchroniser en haut à gauche de l’application Nematode Field Sampling .REMARQUE: Les téléchargements peuvent prendre plusieurs minutes sans connexion cellulaire forte, il peut donc être préférable d’attendre l’accès WiFi. Les données resteront sur les appareils mobiles et seront synchronisées avec le cloud. Expédiez les échantillons à un établissement d’origine en les plaçant dans une boîte d’expédition de nuit. Minimiser le temps pendant lequel les échantillons sont exposés à des températures inférieures à 11 °C ou supérieures à 25 °C en expédiant des colis les jours où la cargaison est transportée.REMARQUE: La plupart des installations d’expédition n’expédient pas de marchandises pendant la nuit les fins de semaine dans des endroits éloignés. 3. Placage des collections sur le terrain en laboratoire REMARQUE: Cette section explique comment organiser le transfert d’échantillons de sacs de collecte étiquetés vers des plaques étiquetées. Les échantillons peuvent provenir d’un envoi de nuit ou directement du champ. Recevez l’expédition des collections et inspectez les sacs cassés ou toute autre preuve de dommage. Si les sacs sont cassés, jetez le matériau et nettoyez les sacs de collecte ininterrompus avec 70% d’éthanol; évitez l’étiquette C sur le sac avec l’éthanol car cela décolorera l’étiquette et la rendra difficile à lire. Pour chaque sac à fermeture à glissière, notez l’étiquette C sur le sac et attachez une étiquette C assortie au couvercle d’une plaque de 10 cm tachetée de bactéries OP50.REMARQUE: Les plaques étiquetées de 10 cm sont appelées « plaques C » pour le reste du protocole. La façon la plus simple d’organiser les échantillons est de placer les sacs de prélèvement sur un banc de laboratoire avec la plaque C correspondante sur le dessus (Figure 3). Pour chaque prélèvement, transférez environ une cuillère à soupe d’échantillon du sac de prélèvement à la plaque C à l’aide d’une cuillère en plastique propre. Ajouter l’échantillon autour de la pelouse bactérienne en forme de croissant ou d’anneau, ne pas couvrir complètement la pelouse bactérienne (Figure 4).REMARQUE: Gardez la cuillère à soupe propre en la plaçant dans un bécher d’éthanol à 95% lorsqu’elle n’est pas utilisée. Utilisez une serviette en papier pour sécher la cuillère à soupe avant de transférer des échantillons supplémentaires. Notez l’heure à laquelle les collections ont été transférées des sacs de collecte aux plaques C et conservez les plaques C à température ambiante (RT) pendant au moins 24 heures avant de tenter d’isoler les nématodes dans la section 4. 4. Isoler les nématodes des collections Ouvrez l’application Fulcrum sur l’appareil mobile et choisissez Isolation des nématodes dans le menu de l’application (Figure 5A). Créez un nouvel enregistrement d’isolement en appuyant sur l’icône + en bas à droite (Figure 5B). Dans le nouvel écran d’enregistrement d’isolement, confirmez le projet de collection correct en cochant le nom du projet affiché dans la zone en haut au centre. Si le mauvais projet s’affiche, appuyez sur le nom du projet pour basculer vers le bon projet (Figure 5C). Appuyez sur le bouton Sélectionner sous le champ étiquette C pour trouver l’étiquette C associée à l’échantillon à partir duquel les nématodes sont isolés (Figure 5D). Appuyez sur l’icône Rechercher , puis sur l’icône Scan pour scanner le code QR de l’étiquette C sur la plaque C avec l’appareil photo de l’appareil. Une fois le code QR scanné, un enregistrement C-label apparaîtra dans le champ C-label . Appuyez sur l’icône Appareil photo dans le champ Photos pour ouvrir l’appareil photo de l’appareil et l’utiliser pour prendre une photo de l’échantillon sur la plaque C avec le code QR visible (Figure 5E). Appuyez sur Terminé pour revenir à l’écran Isolation.REMARQUE: Ces photos d’enregistrement d’isolement peuvent être utilisées pour explorer ultérieurement des attributs spécifiques du substrat. Utilisez un microscope à dissection pour rechercher des nématodes sur la plaque C. Appuyez sur le champ Vers sur l’échantillon pour enregistrer la présence de nématodes sur l’échantillon (Figure 5F). Appuyez sur Oui si des nématodes sont présents sur la plaque C et appuyez sur Non si aucun nématode n’est présent. Appuyez sur Pistes si seules des traces de nématodes sont présentes. Si aucun nématode n’est présent, parafilmer la plaque C et la jeter dans un bac à risque biologique.REMARQUE: Inverser la plaque C sur la poubelle des risques biologiques et tapoter doucement l’arrière de la plaque pour déloger tous les substrats échantillonnés. Cette étape facilite la recherche et l’isolement des nématodes qui peuvent se trouver sous le substrat sur la plaque C. Si des nématodes sont présents, isolez jusqu’à cinq nématodes de la plaque C. Pour isoler un nématode, transférez un nématode de la plaque C vers une plaque S à l’aide d’un pic à fil de platine. Isolez les adultes gravides en bonne santé si possible. Cependant, isolez d’autres stades si les adultes ne sont pas trouvés.REMARQUE: Après l’isolement, jusqu’à cinq plaques S auront chacune un seul nématode sur elles. Gardez ces plaques S avec des nématodes isolés de la même plaque C organisées ensemble dans une pile soignée loin des autres plaques S jusqu’à ce qu’elles soient entrées dans Fulcrum. Appuyez sur le champ Plaques marquées S pour entrer la ou les plaques S utilisées pour cette isolation. Appuyez sur le + en bas à droite. Appuyez sur S-label , puis cliquez sur Scan pour ouvrir la caméra de l’appareil. Utilisez l’appareil photo de l’appareil pour scanner le code QR de l’étiquette S sur la plaque S.REMARQUE : Assurez-vous que le code S-label correspond au code sur la plaque. Si cela correspond, appuyez sur Terminé. Si ce n’est pas le cas, appuyez sur Annuler et réanalysez jusqu’à ce qu’il corresponde, puis cliquez sur Terminé. Parfois, les codes QR des plaques voisines sont accidentellement scannés. Après avoir entré chaque plaque S, enregistrez l’entrée avec le bouton Enregistrer en haut à droite. L’entrée sera perdue si elle n’est pas enregistrée. Appuyez sur le + en bas à droite pour ajouter plus de plaques marquées S si nécessaire jusqu’à ce que tous les nématodes isolés de la plaque C soient entrés. Après avoir ajouté toutes les plaques étiquetées S pour l’enregistrement d’isolation, appuyez sur le bouton < en haut à gauche pour revenir à l’écran d’enregistrement d’isolement.REMARQUE: Pour annuler un enregistrement d’isolement car les erreurs ne peuvent pas être résolues, cliquez sur Annuler en haut à gauche. Cette étape ouvrira une boîte de dialogue demandant si l’enregistrement peut être ignoré sans enregistrement. Si vous le souhaitez, cliquez sur Oui, Jeter. Appuyez sur le bouton Enregistrer en haut à droite une fois que tous les informations ont été correctement ajoutés dans l’enregistrement d’isolement. Ensuite, parafilmez les plaques S avec des nématodes isolés et mettez-les de côté dans une zone désignée pour contenir les plaques S avec des nématodes. Parfilmer la plaque C et la jeter dans le bac à risque biologique. Appuyez sur l’icône Synchroniser pour télécharger toutes les données sur Fulcrum. Triez toutes les plaques S dans l’ordre alphanumérique, puis placez les plaques S dans des boîtes en carton. Assurez-vous que les plaques S sont côté couvercle vers le bas et parafilmées. Empilez jusqu’à quatre plaques S dans une position dans la boîte et étiquetez la boîte en carton avec le nom du projet, la date, l’heure et un numéro de boîte unique. Conservez les boîtes étiquetées à RT. Ces isolats seront contrôlés pour la prolifération à 48 h et à nouveau à 168 h si nécessaire. 5. Exportation de plaques S à partir de Fulcrum Remarque : Cette section explique comment exporter des étiquettes S utilisées dans le processus d’isolement à partir de la base de données du projet Fulcrum. Ces étiquettes S seront utilisées pour suivre les lignes isofémales proliférantes pendant qu’elles sont identifiées par l’identité de la séquence dans les sections 6 à 9. Connectez-vous au site Web Fulcrum et sélectionnez l’application Isolation des nématodes . Cliquez sur Exporter sur le côté gauche de l’écran. Cliquez pour sélectionner le projet souhaité et cochez la case Isolation des nématodes . Cliquez sur Suivant pour télécharger un fichier .zip contenant le fichier « nematode_isolation_s_labeled_plates.csv ». Ouvrez le fichier ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ et triez-le par la colonne ‘S-label’ dans l’ordre croissant (le plus petit S-label sera en haut). Sélectionnez toutes les étiquettes S et copiez-les à partir de la feuille de calcul. Accédez au modèle de génotypage d’isolat sauvage Google Sheet (wild_isolate_genotyping_template) à l’aide d’un navigateur Web19. Faites une copie de cette feuille Google en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’onglet Modèle de génotypage , puis en sélectionnant l’option Copier dans une nouvelle feuille de calcul . Sélectionnez Ouvrir une feuille de calcul pour afficher la nouvelle feuille Google. Nommez cette nouvelle feuille avec le nom du projet pivot suivi de « wild_isolate_genotyping », par exemple, « 2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping ».REMARQUE: Cette feuille est appelée « feuille de génotypage » dans le reste du protocole. Collez les étiquettes S copiées à partir de la colonne « nematode_isolation_s_labeled_plates.csv » « s_label » dans la colonne de la feuille de génotypage intitulée « s_label ». Vérifiez la colonne ‘s_label_repeat_error’ pour ‘1’s. Une valeur de ‘1’ dans cette colonne signifie que l’étiquette S est dupliquée quelque part sur la feuille de génotypage. Si des doublons sont découverts, examinez-les et corrigez-les avant d’aller de l’avant. Remplissez la colonne « isolation_box_number » de la feuille de génotypage pour toutes les étiquettes S. 6. Vérifier la prolifération sur les plaques S Vérifiez la prolifération des animaux sur les plaques S 48 h après l’isolement (utilisez la date et l’heure du dernier isolement sur la boîte de l’étape 4.11 pour guider le moment).REMARQUE: Les nématodes proliférants sont caractérisés par une progéniture sur la plaque S. Si une plaque S prolifère, entrez « 1 » dans la colonne proliferation_48 de la feuille de génotypage, puis déplacez la plaque S dans une case intitulée « Prolifération de 48 h, case 1 ». Placez un maximum de 88 plaques S dans une boîte de prolifération, puis commencez à remplir une nouvelle boîte étiquetée « Prolifération de 48 h, boîte 2 ». Assurez-vous que les étiquettes S sont organisées dans l’ordre alphanumérique dans les boîtes de prolifération de 48 h.REMARQUE: Ne pas jeter les plaques S non proliférantes; ces plaques seront vérifiées à nouveau à 168 h après l’isolement. Si vous le souhaitez, consolidez ces plaques S dans l’ordre numérique dans des cases étiquetées « 48 h non proliférant, case X », mais n’oubliez pas d’enregistrer quand la coche de 168 h doit se produire sur la nouvelle boîte. Après avoir identifié toutes les étiquettes S proliférantes à 48 h, passez à la section 7 pour les plaques S avec prolifération à 48 h. Vérifiez à nouveau les plaques S qui ne proliféraient pas à 48 h après l’isolement à 168 h après l’isolement. Si une plaque S prolifère maintenant, entrez « 1 » dans la colonne proliferation_168 de la feuille de génotypage, puis déplacez la plaque S dans une case intitulée « Prolifération de 168 h, case 1 ». Placez un maximum de 88 plaques S dans une boîte de prolifération, puis commencez à remplir une nouvelle boîte étiquetée « Prolifération de 168 h, boîte 2 ». Assurez-vous d’organiser les étiquettes S dans l’ordre alphanumérique dans les boîtes de prolifération de 168 h. Jetez les plaques S qui n’ont pas de prolifération après 168 h. Passez à la section 7 pour les plaques S avec prolifération à 168 h. 7. Lyse des raies isofemales REMARQUE: Cette étape utilisera l’outil de filtrage de données dans Google Sheets pour aider à imprimer des feuilles de calcul de lyse pour les plaques S dans les boîtes de prolifération. Le but des feuilles de travail de lyse est de fournir au personnel les positions correctes pour les étiquettes S dans les tubes à bandes de lyse au banc. Ouvrez la feuille de génotypage du projet souhaité et sélectionnez toutes les cellules en tapant Cmd+A. Cliquez sur Données > Créer un filtre pour ajouter un bouton de filtre à chaque en-tête de colonne. Utilisez les boutons Filtre pour afficher uniquement les plaques S qui seront génotypées. Par exemple, si toutes les plaques S avec prolifération à 48 h doivent être lysées: Cliquez sur le bouton Filtre dans la colonne ‘proliferation_48’ et sélectionnez ‘1’. Une fois que la feuille Google de génotypage a été filtrée, examinez la liste des étiquettes S affichées pour vous assurer qu’il s’agit des étiquettes S à imprimer sur la feuille de calcul. Dans la colonne ‘strip_tube_number’ de la feuille Google de génotypage, entrez un numéro unique toutes les 11 lignes. Entrez les numéros de tube à bande d’un projet dans l’ordre successif à partir de 1 et jamais dupliqués. Dans la strip_tube_position, entrez 2 à 12 pour chaque numéro de tube à bande.REMARQUE: Utilisez des tubes à bande de 12 tubes pour la lyse. La première position (strip_tube_position 1) sera le contrôle, mais les contrôles ne sont pas ajoutés aux feuilles de calcul de lyse (seuls les strip_tube_positions sont ajoutés, 2-12). Au moment de la lyse, la souche témoin positive « N2 » sera ajoutée à la position 1 de chaque tube à bande paire en tant que témoin positif. Aucun ver n’est ajouté à la position 1 de chaque tube à bande impaire comme témoin négatif. Filtrez davantage la feuille Google de génotypage pour n’inclure que les étiquettes S dans une boîte de prolifération à lyser, puis sélectionnez les colonnes « s_label » à « lysis_notes ». Imprimez une feuille de calcul de lyse pour chaque boîte de prolifération à lyser. Cliquez sur le menu déroulant dans le champ Imprimer et sélectionnez Cellules sélectionnées. Cliquez sur Suivant en haut à droite, puis utilisez la boîte de dialogue pour imprimer la feuille de calcul de lyse de la zone de prolifération. Répétez les étapes 7.3 à 7.5 pour imprimer une feuille de calcul de lyse pour chaque boîte de prolifération.REMARQUE: Chaque boîte de prolifération peut contenir jusqu’à 88 plaques S, ce qui correspond à huit tubes à bande de 12 puits. Préparez des tubes à bande de 12 puits pour tous les échantillons qui seront lysés. Étiquetez un tube à bande avec un « strip_tube_number » unique attribué dans la feuille de calcul de lyse. Cette étiquette doit être apposée sur la bande de bouchon et le tube de bande pour éviter toute confusion s’ils sont séparés. Les tubes à bande EVEN ont un contrôle positif (vers N2) en position 1. Les tubes à bande ODD ont un contrôle négatif (pas de vers) en position 1. Constituer suffisamment de tampon de lyse (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM MgCl2, 0,9 % IGEPAL, 0,9 % Tween 20, 0,02 % gélatine avec protéinase K ajoutée à une concentration finale de 0,4 mg/mL) pour tous les échantillons et ajouter 5 % supplémentaires pour l’erreur de pipette. Évoluez si nécessaire.REMARQUE: Le tampon de lyse est mieux préparé en combinant tous les ingrédients à l’exception de la protéinase K et en les congelant dans des aliquotes de 10 à 50 mL à -20 ° C. Décongeler les aliquotes et les conserver à 4 °C avant utilisation; immédiatement avant utilisation, ajouter la protéinase K et bien mélanger. Gardez le tampon de lyse sur la glace pendant que vous travaillez. Disposez les plaques S pour un tube à bande particulier dans l’ordre en utilisant la feuille de calcul de lyse imprimée comme guide. Décapsulez un tube de bande et ajoutez 8 μL de tampon de lyse à chaque bouchon avec un pipetteur répétitif. Ajoutez le tampon de lyse à une bande de bouchons à la fois, car le tampon de lyse s’évaporera s’il est laissé à TA et découvert. Choisissez 3 à 5 animaux dans les plaques sources (plaque S ou plaque mère N2 pour les témoins positifs) dans les positions de capuchon appropriées indiquées sur la feuille de travail de lyse. Enregistrez les notes pour toute plaque S avec moins de 5 vers prélevés sur la lyse dans la section lysis_notes de la feuille de calcul de lyse. Après avoir chargé les nématodes dans chaque position du tube de bande, replacez la bande de capuchon sur le tube de bande. Faites correspondre le capuchon marqué (position 1) avec le tube marqué (position 1). Une fois bouché, centrifugez brièvement le tube à bande jusqu’à ce que les nématodes soient au fond du tube. Placer la bande au congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit complètement congelée (au moins 10 min). Répétez les étapes 7.9 à 7.11 jusqu’à ce que des nématodes soient ajoutés pour la lyse dans toutes les bandelettes. Organisez les bandes de tubes dans l’ordre numérique. Retirez les jeux de tubes à bande et exécutez le programme de lyse dans un thermocycleur : 1 h à 60 °C, 15 min à 95 °C, maintenez à 12 °C. Lorsque le programme de lyse est terminé, faites tourner les échantillons à 300 x g pendant 15 s à TA et conservez les lysats à -80 °C pendant 1 semaine. Organisez les bandes de tubes dans l’ordre numérique à l’aide de porte-plaques à 96 puits et incluez une étiquette avec un numéro de boîte de prolifération, une plage de numéros de tube à bande, la date et les initiales du chercheur. Mettez à jour les colonnes de la feuille de génotypage « lysis_date » et « lysis_notes » avec les informations de la feuille de calcul de lyse. 8. PCR des séquences SSU et ITS2 REMARQUE: Cette section fournira des instructions sur la façon d’effectuer deux PCR distinctes pour chaque plaque S lysée. Le premier ensemble d’amorces amplifie un fragment de 500 pb du gène de la petite sous-unité (SSU) de l’ADNr 18S; oECA1271 = amorce avant TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = amorce inverse CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12. Cette PCR est utilisée pour vérifier la qualité de l’ADN du modèle. La PCR amplifie la région SSU pour presque toutes les espèces de nématodes. Si la PCR SSU ne parvient pas à s’amplifier, ce résultat suggère que la qualité de la lyse est médiocre et que la lyse doit être répétée pour cette plaque S. Le deuxième ensemble d’amorces amplifie un fragment de 2 000 bp de la région interne transcrite de l’espaceur entre les gènes d’ADNr 5,8S et 28S (ITS2); oECA1687 = amorce avant CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = amorce inverse GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. Le produit de PCR ITS2 est séquencé par Sanger et la séquence est utilisée pour identifier les nématodes du genre Caenorhabditis au niveau de l’espèce par similitude de séquence. Utilisez l’outil de filtrage de la feuille de génotypage pour afficher uniquement les étiquettes S à utiliser pour la PCR. Mettez à jour les pcr_plate_number et pcr_well colonnes de la feuille de génotypage. Pour éviter la dégradation du matériau de lyse, les PCR SSU et ITS2 sont exécutées en même temps. Utilisez les mêmes pcr_plate_number pour les PCR ITS2 et SSU, même s’il s’agit de réactions distinctes dans des plaques séparées. Ils seront distingués par des labels « SSU » ou « ITS2 ». Attribuez un pcr_plate_number à huit tubes à bande ou moins (un tube à bande par rangée de la plaque PCR à 96 puits, disposés dans l’ordre croissant, par exemple, le numéro de tube à bande le plus bas sur le dessus). Attribuez ensuite une pcr_plate_well à chaque étiquette S dans les tubes à bandes.REMARQUE: Les tubes à bande sont disposés dans l’ordre croissant, le numéro de tube à bande le plus bas étant attribué à la rangée A et le nombre le plus élevé à la rangée H. La position 1 de tous les tubes à bande est attribuée à la colonne 1. Par conséquent, le tube à bande numéro 1, position 1 sera attribué à la plaque PCR numéro 1, puits A01. Étiquetez la ou les plaques de PCR à 96 puits pour accueillir les échantillons qui seront utilisés pour la PCR. Étiquetez chaque plaque PCR avec les informations suivantes : nom du projet, type de PCR, numéro de plaque PCR et date de PCR (par exemple, 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). En outre, étiquetez la plaque avec les numéros de tube à bande qui seront chargés dans chaque rangée. Retirer le matériau de lyse du congélateur à -80 °C et décongeler les tubes à bande contenant le matériau de lyse sur de la glace. Pendant que le matériau de lyse est en train de décongeler, préparez les mélanges maîtres ITS2 et SSU dans des tubes séparés sur de la glace. Les recettes de PCR SSU et ITS2 se trouvent dans le tableau supplémentaire 2.REMARQUE: Préparer 100 réactions de mélange maître PCR pour chaque plaque de 96 puits afin de permettre une erreur de pipetage. Utilisez un conique de 15 mL ou 50 mL pour maintenir le mélange maître si de grands volumes doivent être utilisés. Vortex le mélange maître doucement jusqu’à ce que Taq soit distribué dans tout le mélange. Une fois mélangé, aliquote 38 μL du mélange maître dans les puits appropriés des plaques pcR sur glace. Utilisez des bacs stériles à fond en V à usage unique et une pipette multicanal à 12 puits pour transférer le mélange maître sur les plaques de PCR. Faites tourner les tubes de bande de lyse décongelés pour éliminer le matériau de lyse des bouchons. Retirez soigneusement les couvercles de tous les tubes à bande qui seront chargés dans la première plaque PCR. Utilisez une pipette multicanal à faible volume (12 puits ou 8 puits) pour ajouter 2 μL de lysat au puits approprié dans la plaque PCR. Pipettez doucement le lysat de haut en bas une fois avant de retirer les 2 μL.REMARQUE: Vérifiez les conseils pour vous assurer qu’ils contiennent la lyse avant le transfert. N’oubliez pas de modifier les conseils entre les lignes ou les colonnes. Couvrez la plaque PCR avec une feuille adhésive PCR et utilisez un rouleau pour créer un joint étanche. Une fois la feuille appliquée, faites tourner brièvement les plaques pcR dans une centrifugeuse. Gardez la plaque sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à fonctionner dans le thermocycleur. Exécutez les PCR avec le programme de thermocycleur approprié. Reportez-vous au tableau supplémentaire 2 pour plus de détails sur les programmes de PCR SSU et ITS2. Répétez les étapes 8.4 à 8.8 jusqu’à ce que tous les PCR soient exécutés. Pendant que les réactions de PCR sont en cours, versez un gel d’agarose de 100 mL à 1,5%. Chaque gel contiendra des échantillons ou une seule plaque de PCR. Ajouter 1,5 g d’agarose dans une fiole de 500 mL, puis ajouter 100 mL de tampon TAE 1x (tableau supplémentaire 3) et faire tourbillonner pour mélanger. Micro-ondes pour dissoudre et refroidir le gel. Une fois la solution refroidie, ajouter 5 μL de solution de bromure d’éthidium de 10 mg/mL et mélanger pour combiner. Versez la solution dans un plateau de coulée avec quatre peignes de 25 puits afin que le gel puisse accueillir 96 échantillons plus une échelle pour chaque rangée du gel.REMARQUE: Le bromure d’éthidium est un mutagène puissant. Lorsque vous manipulez du bromure d’éthidium, utilisez une blouse de laboratoire, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes de sécurité chimique. Juste avant la fin de la PCR, ajoutez 6x colorant de chargement à une auge jetable et utilisez une pipette multicanal pour ajouter 2 μL de colorant de charge 6x à chaque puits d’une nouvelle plaque de PCR de 96 puits. Cette plaque sera utilisée pour charger les échantillons dans le gel. Faites suffisamment de ces plaques pour accueillir tous les échantillons. Lorsque les PCR sont terminées, retirez les plaques de PCR et centrifugez-les brièvement à 300 x g pendant 15 s à RT. Conservez les plaques de PCR sur de la glace jusqu’à ce que les produits de PCR puissent être épuisés sur un gel. Pour exécuter les produits sur un gel, utilisez une pipette multicanal à 12 puits pour ajouter 5 μL de chaque échantillon au puits approprié d’une plaque de 96 puits contenant 2 μL de colorant à chargement 6x. Chargez ensuite 6 μL de ce mélange dans chaque puits d’un gel récemment coulé. Chargez 6 μL de 1 Ko plus échelle dans le premier puits de chaque rangée de gel.REMARQUE: Pour remplir les puits du gel, il peut être nécessaire d’intercaler les rangées A et B de la plaque PCR dans la première rangée du gel. Pour éviter toute confusion, notez les gel_number et gel_position dans la fiche de génotypage pour chaque échantillon de PCR. Placez un nouveau couvercle en aluminium sur le reste de la PCR dans la ou les plaques et conservez-les à 4 °C. Ces produits de réaction seront utilisés pour le séquençage à l’étape 9. Exécutez les produits PCR sur le gel à 120 V pendant 20 min. Imagez le gel et notez quelles étiquettes S donnent des produits ITS2 et/ou SSU PCR dans les colonnes « pcr_product_its2 » et « prc_product_ssu » de la fiche de génotypage. Marquez la présence d’un groupe avec un « 1 » ; marquez un « 0 » pour aucune bande. 9. Identification des nématodes avec le séquençage de Sanger et la séquence BLAST REMARQUE: Cette section fournit des instructions pour le séquençage des amplicons ITS2 à partir des étiquettes S, l’alignement de ces séquences sur la base de données du National Center for Biotechnology Information (NCBI) à l’aide de l’algorithme BLAST et l’analyse des résultats BLAST pour identifier les nématodes sur les plaques S. Pour chaque échantillon positif à l’ITS2, utilisez le produit de PCR ITS2 restant pour le séquençage de Sanger à l’aide de l’amorce directe oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Faites en sorte que les fichiers de sortie de séquençage soient facilement liés à une étiquette S en enregistrant les colonnes « sequencing_plate » et « sequencing_well » de chaque étiquette S dans la feuille de génotypage. Obtenez les fichiers de sortie .seq pour chaque étiquette S à partir de la plate-forme de séquençage. Organisez les fichiers .seq d’un projet dans un répertoire unique avec des fichiers .seq pour chaque lot de séquençage situé dans des sous-répertoires. Ouvrez l’outil d’interface de ligne de commande et accédez au répertoire supérieur contenant les fichiers .seq en entrant la commande : cd . S’il n’existe pas déjà, créez un FASTA fusionné pour tous les fichiers .seq en entrant la commande suivante: pour dir dans */; do cd $dir; pour file dans *.seq; do echo « >”$file; cat $file; done >>.. /all_seqs.fa; cd ..; C’est fait.REMARQUE: Ce code créera un fichier FASTA fusionné nommé ‘all_seqs.fa’ à partir de tous les fichiers .seq dans le répertoire du projet. Ce fichier peut être utilisé dans l’outil BLAST nucléotidique en ligne du NCBI pour aligner rapidement la séquence ITS2 de chaque étiquette S sur la base de données de séquences du NCBI. Dans un navigateur Web, accédez au site Web NBCI BLAST20 et cliquez sur le bouton Choisir un fichier . Sélectionnez le fichier all_seqs.fa qui vient d’être créé, puis cliquez sur le bouton Séquences quelque peu similaires (BLASTn). Cliquez sur le bouton BLAST en bas de la page pour lancer la recherche BLAST. Mettez à jour la feuille de génotypage avec les résultats BLAST pour chaque étiquette S. Utilisez l’outil de filtrage pour faciliter la mise à jour de la feuille Google de génotypage. Cliquez sur Données > Créer un filtre pour ajouter un bouton de filtre à chaque en-tête de colonne. Filtrez la colonne sequencing_plate pour sélectionner les plaques de séquençage à mettre à jour avec les résultats BLAST. Utilisez le menu déroulant de la page de résultats NCBI BLAST pour vérifier les résultats de chaque séquence ITS2 de plaque S (Figure 6). Vérifiez qu’il n’y a pas de coups BLAST. Un ID de séquence dans la liste déroulante préfixé par * n’a pas de coups de souffle. Pour ces étiquettes S, entrez « no hit » dans la colonne manual_blast_notes de la feuille de génotypage. Vérifiez s’il existe une nouvelle espèce possible de Caenorhabditis . Cliquez sur le lien en haut pour visualiser l’alignement (Figure 6). Si le résultat maximal est (1) une espèce de Caenorhabditis , (2) l’alignement contient plus de cinq incohérences au centre de la séquence et (3) la couverture de la requête est supérieure à 50 %, ce résultat suggère que l’isolat pourrait être une nouvelle espèce de Caenorhabditis (Figure 7). Pour ces plaques S, entrez, les espèces du BLAST supérieur ont frappé dans la colonne « species_id », entrez un 1 dans la colonne « possible_new_caeno_sp » et « possible nouveau Caeno sp. » dans la colonne « manual_blast_notes » avec l’identité en pourcentage (par exemple, « identité possible de Nouveau Caeno sp. 89% »). Pour les séquences de plaque S qui blast à une espèce de Caenorhabditis , entrez le genre complet et le nom d’espèce du blast supérieur dans la colonne « species_id ». Par exemple, ‘Caenorhabditis elegans’. Pour les séquences de plaque S qui BLAST à une espèce non-Caenorhabditis , entrez uniquement le genre de la frappe BLAST supérieure suivie de « sp. » dans la colonne « species_id ». Cette notation signifie que l’isolat est une espèce inconnue du genre nommé. Par exemple, ‘Oscheius sp.’.REMARQUE: La séquence ITS2 ne peut pas être utilisée pour identifier de manière fiable les isolats au niveau de l’espèce en dehors du genre Caenorhabditis3,13. Entrez 1 dans la ‘colonne make_strain_name’ de la feuille de génotypage si ‘species_id’ = ‘Caenorhabditis elegans’, ‘Caenorhabditis briggsae’ ou ‘Caenorhabditis tropicalis’, OU ‘possible_new_caeno_sp’ = 1. Nommez les souches avec des noms uniques suivant les conventions de nomenclature Caenorhabditis , c’est-à-dire une désignation de laboratoire unique composée de 2 à 3 lettres majuscules suivies d’un nombre pour chaque souche unique23. Entrez les noms des souches dans la colonne « strain_name ». Une fois les souches nommées, elles peuvent être cryoconservées à l’aide des protocoles établis 24. 10. Traitement des données de collecte avec le package easyFulcrum dans R REMARQUE : cette étape décrit comment lier les données de collecte (étiquettes C) et les données d’isolement des nématodes (étiquettes S) à l’aide du package easyFulcrum R. Le logiciel contient des fonctions qui relieront davantage les données de Fulcrum aux données de génotypage de la feuille de génotypage afin que les identités d’espèces et les noms de souches de l’étiquette S soient organisés dans un seul cadre de données. Créez un répertoire nommé pour le projet de collection. Organisez la structure de dossiers dans le répertoire pour qu’elle corresponde aux exigences décrites dans le package R easyFulcrum15. Accédez au site Web Fulcrum et connectez-vous. Exportez les données brutes du projet à partir de la base de données Fulcrum à l’aide de l’outil d’exportation de données du site Web Fulcrum sur la gauche et en cochant les cases suivantes : projeter, inclure des photos, inclure des données GPS, échantillonnage sur le terrain et isolement.REMARQUE : Les données Fulcrum du projet seront exportées sous la forme de cinq fichiers de valeurs (.csv) séparés par des virgules. Les données complètes du projet seront réunies en une seule trame de données à l’aide du package easyFulcrum dans R. Déplacez les cinq fichiers .csv exportés de Fulcrum dans le répertoire de projet créé à l’étape 10.1 comme indiqué dans la vignette easyFulcrum21. Ouvrez une session Rstudio et installez le paquet easyfulcrum dans R en entrant les commandes suivantes dans la console R ‘install.packages(« devtools »)’ et ‘devtools::install_github(« AndersenLab/easyfulcrum »)’. Ouvrez un nouveau script R et suivez les instructions de la vignette easyfulcrum pour traiter les données de collecte21.