Summary

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

Published: January 05, 2022
doi:

Summary

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

Abstract

תנועתיות נוהרת חיידקית היא פנוטיפ מיקרוביולוגי נפוץ שקהילות חיידקים משתמשות בו כדי לנדוד על פני משטחים חצי-קוליים. בחקירות של תנועתיות נחיל המושרה, ריכוז ספציפי של ממריץ לא יוכל לדווח על אירועים המתרחשים בטווח הריכוז האופטימלי כדי לעורר את התגובות הרצויות ממין. לוחות semisolid המכילים ריכוזים מרובים משמשים בדרך כלל כדי לחקור את התגובה בתוך טווח ריכוז ממריץ. עם זאת, לוחות חצי-סוליד נפרדים מגבירים את הווריאציות בצמיגות בינונית ובתכולת לחות בתוך כל צלחת עקב זמן התגבשות לא יוניפורמי.

מאמר זה מתאר שיטה חד-שלבית לבדיקת תנועתיות נוהרת משטח בו זמנית על צלחת הדרגתית אחת, שבה בארות הבדיקה המסודרות באופן איזומטרי מאפשרות רכישה סימולטנית של תגובות רב-מרכזיות. בעבודה הנוכחית, נחיל פני השטח של Escherichia coli K12 ו Pseudomonas aeruginosa PAO1 הוערכו בתגובה שיפוע ריכוז של ממריצים כגון רזברטרול ו arabinose. מעת לעת, המורפולוגיות של הנחיל צולמו באמצעות מערכת הדמיה כדי ללכוד את כל תהליך נחיל פני השטח.

המדידה הכמותית של מורפולוגיות הנחיל נרכשה באמצעות תוכנת ImageJ, המספקת מידע ניתן לניתוח של אזור הנחיל. מאמר זה מציג שיטת לוח נחיל שיפוע פשוט המספקת מידע איכותי וכמותי על ההשפעות של הממריצים על נחיל פני השטח, אשר ניתן להרחיב כדי ללמוד את ההשפעות של ממריצים אחרים על מגוון רחב יותר של מינים חיידקיים רגש.

Introduction

תנועתיות נוהרת חיידקית מתייחסת להגירה קולקטיבית של תאים חיידקיים על פני השטח של חומר. בנוסף לוחות אגר semisolid שהוכנו במיוחד במעבדה1, פנוטיפ זה נצפה גם על כמה מצעים רכים כגון רקמות בעלי חיים2, משטחים hydrated3, ושורשי צמחים4. בעוד משטח חצי-סוליד נחשב לאחד התנאים הבסיסיים עבור נחיל חיידקים, מינים מסוימים דורשים גם מדיום עשיר באנרגיה כדי לתמוך תנועתיות הנוהרת שלהם5. סיבוב פלאגלה מפעיל הן שחייה והן שחיית תנועתיות שורצת מתאר את תנועתיות חד-תאית בתוך סביבה נוזלית, ואילו נחיל הוא תנועה סינכרונית של אוכלוסייה מיקרוביאלית על פני משטחים חצי-קוליים.

צמיגות מצע משפיעה על תנועתיות חיידקים; מחקרים של חיידקים פתוגניים, כגון הליקובקטר פילורי, הראו כי תנועתיות הפתוגן משתנה בהתאם לצמיגות שכבת המוצין, המושפעת מהחמצה סביבתית במארח האנושי6. כדי לשכפל סביבות אלה, מחקרים קודמים באמצעות ריכוז אגר מעל 0.3% (w / v) להגביל תנועתיות שחייה חיידקית כדי לבצע שינוי הדרגתי לתוך נחיל פני השטח. השימוש בריכוז אגר מעל 1% (w / v) מונע את תנועתיות נחיל של מינים רבים7. דפוסי המושבה הנוצרים על פני השטח הם מגוונים, כולל mat8 ללא תכונות, עין שור9, dendrites10, ו מערבולת11.

למרות הרלוונטיות של דפוסים כאלה עדיין לא ברור, דפוסים אלה נראים תלויים רמזים סביבתיים וכימיים12. רמזים סביבתיים מכסים היבטים שונים, כולל טמפרטורה, מליחות, אור ו- pH, ואילו רמזים כימיים כוללים נוכחות של מולקולות חישת מניין מיקרוביאלי, תוצרי לוואי ביוכימיים וחומרים מזינים. מולקולות איתות של מניין Autoinducer כגון AHL (לקטון הומוסרין N-hexanoyl-L) יכול להשפיע על נחיל פני השטח על ידי ויסות הייצור של פעילי שטח13,14. רזברטרול, תרכובת פיטואלקסין, יכול להגביל תנועתיות נחיל חיידקים15.

בעבודה הנוכחית, אנו חוקרים את ההשפעה של ריכוזים הדרגתיים של רזברטרול על סוג בר Escherichia coli K12 זן ולחקור תנועתיות נחיל arabinose-inducable של מהונדס E. coli K12-YdeH ו Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH מינים. הייצור של האנזים YdeH מושרה על ידי arabinose באמצעות מקדם araBAD, וכתוצאה מכך הפרעה c-di-GMP הסלולר והשפעה על תנועתיות נוהר חיידקים16,17. התנהגות נחיל בלתי ניתנת לחינוך זו נחקרת באמצעות לוחות נחיל הדרגתיים arabinose עם E. coli K12-YdeH ו P. aeruginosa PAO1-YdeH זנים.

לוחות הנחיל ההדרגתיים מוכנים על-ידי מיצוק רציף של מדיום דו-שכבתי (איור 1B). השכבה התחתונה כוללת את המדיום שנוסף עם הממריץ, שנמזג על צד אחד של צלחת פטרי. עם התגבשות השכבה התחתונה, צלחת הפטרי מוחזרת למשטח שטוח, שם מוסיפים את השכבה העליונה המכילה את המדיום ללא הממריץ מהצד השני של הצלחת. לאחר שליחות הנחיל מתגמצמים לחלוטין, בארות ההחזקה המסודרות באופן איזומטרי מיוצרות על ידי חורים משעממים בלוחות הנחיל לאחר פריסה קבועה (איור 1C) או על ידי הטבעת הבארות באמצעות דגם מודפס תלת-ממדי של כיסוי הלוח המכיל יתדות במהלך תהליך הריפוי הבינוני (איור S1 משלים). מערכת דימות ג’ל משמשת ללכידת המורפולוגיות הנוהרות בנקודות זמן שונות (איור 2). ניתוח נחיל פני השטח באמצעות תוכנת ImageJ (איור S2 משלים) מספק תוצאות כמותיות של תהליך נחיל פני השטח (איור 3).

לכן, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי לבדוק את תנועתיות נחיל פני השטח בתוך טווח ריכוז של ממריצים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבדוק תגובות ריכוז מרובות של ממריצים אחרים על ידי ערבוב הממריץ למדיום השכבה התחתונה והוא יכול להיות מיושם על מינים אחרים של רגש (למשל, Bacillus subtilis, סלמונלה enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). גישה זו יכולה לספק תוצאות איכותיות וכמותיות אמינות להקרנת ממריץ כימי יחיד, וניתן להשתמש בלוחות נפרדים כדי להעריך יותר ממריצים כימיים.

Protocol

1. הכנת לוחות נחיל הדרגתיים הכנת מדיום נחילהערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת השוואה קצרה של צמיגות בינונית שונה; 0.7% (w / v) ריכוז אגר של מדיום נחיל שימש בפרוטוקול זה. להכין אבקת מרק Lysogeny (LB) עם אגר בשני בקבוקונים חרוטיים; כל בקבוק מכיל 2 גרם טריפטון, 2 גרם של נתרן כלורי, 1 גרם של תמצ?…

Representative Results

זרימת העבודה המורכבת מהכנת לוחות נחיל הדרגתיים, חיסון ודגרה מוצגת באיור 1B. כדי ליצור לוחות שחייה הדרגתיים, המדיום של השכבה התחתונה נשפך לתוך כלים נפוחים ב~4.3° מהמישור האופקי (איור S3 משלים), ולאחר מכן שופך את המדיום של השכבה העליונה לאחר שהשכבה התחתונה מתגובקת לחלוט…

Discussion

חקירה של תנועתיות נחיל חיידקים על לוחות הדרגתיים חצי-אולידים יכולה להיות משימה מאתגרת 18,19,20, שכן היא כוללת גורמים רבים כגון צמיגות מצע, לחות ורכיבים בינוניים. בין גורמים אלה, ריכוז אגר ממלא תפקיד מכריע בקביעת חזרה מיקרוביאלית לשחייה או תנ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פיתוח טכניקה זו נתמך על ידי הכספים מתוכנית המו”פ הלאומית של משרד המדע והטכנולוגיה (2018YF0902604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של קרן המחקר של סין למדענים צעירים בינלאומיים (22050410270) ומכוני שנזן לקרנות חיצוניות טכנולוגיות מתקדמות (DWKF20190001). ברצוננו להביע את תודתנו הכנה למיס צ’ן שינאי על עזרתה בגיהיית המסמך וניהול המעבדה.

Materials

Agar Sigma-Aldrich V900500 500 g
Ampicillin Solarbio A8180 25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube Corning 430790 15 mL
Cryogenic vial Corning 430488 2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Aladdin D103272 AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose Aladdin A106195 98% (GC), 500 g
Petri dishes Bkman B-SLPYM90-15 Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol Aladdin R107315 99% (GC), 25 g
Sodium chloride Macklin S805275 AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes Bkman B-SLPYM130F Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone Thermo Scientific Oxoid LP0042 500 g
Yeast extract Thermo Scientific Oxoid LP0021 500 g
Equipments
Biochemical incubator Blue pard LRH-70
Tanon 5200multi imaging system Tanon 5200CE
Thermostatic water bath Jinghong DK-S28

Riferimenti

  1. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
  2. Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
  3. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
  4. Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
  5. Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
  6. Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
  7. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  8. Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
  9. Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
  10. Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
  11. Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
  12. Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
  13. Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
  14. Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
  15. Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
  16. Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
  17. Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
  18. Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
  19. Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
  20. Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
  21. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  22. Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
  23. Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
  24. Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
  25. Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
  26. Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).

Play Video

Citazione di questo articolo
Guo, S., Liu, Z., Yang, Y., Chen, J., Ho, C. L. Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates. J. Vis. Exp. (179), e63382, doi:10.3791/63382 (2022).

View Video