Summary

Abordagem Cirúrgica Estereotaxic para Microinpor o Tronco Cerebral Caudal e Medula Espinhal Cervical Superior através da Cisterna Magna em Camundongos

Published: January 21, 2022
doi:

Summary

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos geralmente envolve acesso através dos ossos do crânio e é guiada por marcos do crânio. Aqui descrevemos uma abordagem estereotaxa alternativa para atingir o tronco cerebral caudal e a medula espinhal cervical superior através da cisterna magna que se baseia na visualização direta de marcos do tronco cerebral.

Abstract

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos é comumente guiada por marcos do crânio. O acesso é então obtido através de orifícios de rebarba perfurados através do crânio. Esta abordagem padrão pode ser desafiadora para alvos no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior devido a desafios anatômicos específicos, pois esses locais são distantes de marcos do crânio, levando à imprecisão. Aqui descrevemos uma abordagem estereutílica alternativa através da cisterna magna que tem sido usada para atingir regiões discretas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. A cisterna magna estende-se do osso occipital até o atlas (ou seja, o segundo osso vertebral), é preenchida com fluido cefalorraquidiano, e é coberta por dura mater. Esta abordagem fornece uma rota reprodutível de acesso a estruturas selecionadas do sistema nervoso central (CNS) que são de outra forma difíceis de alcançar devido a barreiras anatômicas. Além disso, permite a visualização direta de marcos do tronco cerebral nas proximidades dos locais alvo, aumentando a precisão ao fornecer pequenos volumes de injeção para regiões restritas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. Por fim, essa abordagem oferece uma oportunidade de evitar o cerebelo, que pode ser importante para estudos motores e sensoriais.

Introduction

Cirurgia estereotaxa padrão para atingir locais cerebrais em camundongos1 geralmente envolve fixação do crânio usando um conjunto de barras de ouvido e uma barra de boca. As coordenadas são então estimadas com base em atlas de referência 2,3, e marcos do crânio, ou seja, bregma (o ponto onde as suturas dos ossos frontais e parietal se unem) ou lambda (o ponto onde as suturas dos ossos parietal e occipital se unem; Figura 1A,B). Através de um orifício de rebarba no crânio acima do alvo estimado, a região alvo pode então ser alcançada, seja para entrega de microinjeções ou instrumentação com cânulas ou fibras ópticas. Devido à variação na anatomia dessas suturas e erros na localização de bregma ou lambda 4,5, a posição de zero pontos em relação ao cérebro varia de animal para animal. Embora pequenos erros de segmentação, que resultem dessa variabilidade, não sejam um problema para alvos grandes ou próximos, seu impacto é maior para áreas menores de interesse que são distantes dos pontos zero nos planos anteroposterior ou dorsoventral e/ou ao estudar animais de tamanho variado devido à idade, tensão e/ou sexo. Existem vários desafios adicionais que são únicos para a medula oblongata e a corda cervical superior. Em primeiro lugar, pequenas alterações nas coordenadas anteroposterioras estão associadas a mudanças significativas nas coordenadas dorsoventra em relação à dura, devido à posição e forma do cerebelo (Figura 1Bi)2,6,7. Segundo, a corda cervical superior não está contida no crânio2. Em terceiro lugar, a posição inclinada do osso occipital e a camada excessiva dos músculos do pescoço2 torna a abordagem estereotaxic padrão ainda mais desafiadora para estruturas localizadas perto da transição entre o tronco cerebral e a medula espinhal (Figura 1Bi). Finalmente, muitos alvos de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical são pequenos2, exigindo injeções precisas e reprodutíveis 8,9.

Uma abordagem alternativa através da cisterna magna contorna esses problemas. A cisterna magna é um grande espaço que se estende do osso occipital até o atlas (Figura 1A, ou seja, o segundo osso vertebral)10. É preenchido com fluido cefalorraquidiano e coberto por dura mater10. Este espaço entre o osso occipital e o atlas abre quando a anteroflexão da cabeça. Ele pode ser acessado navegando entre as barrigas emparelhadas excessivamente do músculo longus capitis, expondo a superfície dorsal do tronco cerebral caudal. Regiões de interesse podem então ser alvo com base nos marcos dessas regiões se estiverem localizadas perto da superfície dorsal; ou usando o obex, o ponto onde o canal central se abre no ventrículo IV, como ponto zero para que as coordenadas alcancem estruturas mais profundas. Esta abordagem tem sido usada com sucesso em uma variedade de espécies, incluindo o rato11, gato12, rato 8,9, e primata não humano13 para atingir o grupo respiratório ventral, formação reticular medial medular, o núcleo do trato solitário, área pós-orssal. No entanto, essa abordagem não é amplamente utilizada, pois requer conhecimento de anatomia, um kit de ferramentas especializado e habilidades cirúrgicas mais avançadas em comparação com a abordagem estereotaxa padrão.

Aqui descrevemos uma abordagem cirúrgica passo a passo para alcançar o tronco cerebral e a medula cervical superior através da cisterna magna, visualizamos marcos, definimos o ponto zero (Figura 2), e estimamos e otimizamos coordenadas-alvo para a entrega estereotaxa de microinjeções nas discretas regiões de tronco cerebral e medula espinhal (Figura 3). Em seguida, discutimos as vantagens e desvantagens relacionadas a essa abordagem.

Protocol

O autor declara que o protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center. 1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e quadro estereotaxic NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. A esterilidade é mantida usando a técnica de ponta estéril. Instale o braço estereotaxic com uma micropipette ou seringa preenchida com uma opção injetável (vírus a…

Representative Results

A abordagem cisterna magna torna possível atingir estruturas cerebrais caudais e cordões cervicais superiores que são de outra forma difíceis de alcançar através de abordagens estereotaxas padrão ou são propensas a alvos inconsistentes. A cirurgia para chegar à cisterna magna requer incisões da pele, uma fina camada de músculo trapézio, e abertura da dura mater e, portanto, bem tolerada por camundongos. É especialmente eficiente e menos invasivo ao atingir múltiplos locais (longitudinalmente disper…

Discussion

A cirurgia estereóxica padrão geralmente depende de marcos do crânio para calcular as coordenadas dos locais alvo no CNS1. Os locais alvo são então acessados através de orifícios de rebarba que são perfurados através do crânio1. Este método não é ideal para o tronco cerebral caudal, pois os locais alvo estão localizados distantes dos marcos do crânio nos planos anteroposterior e dorsoventral2 e como a anatomia do crânio e mú…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por R01 NS079623, P01 HL149630 e P01 HL095491.

Materials

Alcohol pad Med-Vet International SKU: MDS090735Z skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45 FST 11251-35 only to grab dura
Betadine pad Med-Vet International SKU:PVP-PAD skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate Thermo Fisher Scientific 488: C34775, 594: C22842 Fluorescent tracer
Clippers Wahl Model MC3, 28915-10 for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp Kopf 1770 to hold glass pipette
Flowmeter Gilmont instruments model # 65 MM to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene Thermo Fisher Scientific F13080 Fluorescent tracer
Heating pad Stoelting 53800M thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit Midmark Inc 93805107 92800131 chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe Exelint International 26028 to administer saline and analgesic
Isoflurane Med-Vet International SKU:RXISO-250 inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer Midmark Inc 91305430 apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2 FST 11223-20 only to clean dura
Medical air, compressed Linde UN 1002 used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR Zoo Pharm LLC Lot # MSR2-211201 analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube Globe Scientific Inc 51628 for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor Stoelting 0051625  adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats FST 91308-12 for suturing
Oxygen regulator Life Support Products S/N 909328, lot 092109 regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed Linde USP UN 1072 provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card not applicable not applicable any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar) World Precision Instruments (WPI) SYS-PV820 For precision solution injection
Saline, sterile Mountainside Medical Equipment H04888-10 to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3 FST 10003-12 to hold scalpel
Scissors, Wagner FST 14070-12 to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box FST 15002-08 scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator Kopf 1760-61 attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate Kopf 1730-B, 1711 frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators Puritan 25-806 10WC absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes Henry Schein 9004686 for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment Puralube P1490 ocular lubricant
Stimulator & Tubing Grass Medical Instruments S44 to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10 Med-Vet International SKU: 10SS for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe FST 11153-10 to hold skin
Surgical gloves Med-Vet International MSG2280Z for asceptic surgery
Surgical microscope Leica Model M320/ F12 for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene Oasis MV-8661 to close the skin
Tegaderm 3M 3M ID 70200749250 provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post Kopf 1725 attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats FST 18200-09, 13003-10 to separate muscles and provide surgical window

Riferimenti

  1. JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
  2. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  3. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  4. Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
  5. Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
  6. Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
  7. Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
  8. Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
  9. Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
  10. Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
  11. Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
  12. Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
  13. Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
  14. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
  15. Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  16. Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
  17. Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).

Play Video

Citazione di questo articolo
Joshi, K., Kirby, A., Niu, J., VanderHorst, V. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (179), e63344, doi:10.3791/63344 (2022).

View Video