QPCR lista para usar para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi u otros organismos patógenos
Summary
El presente trabajo describe los pasos para producir qPCR lista para usar para la detección de ADN de T. cruzi que puede precargarse en el recipiente de reacción y almacenarse en el refrigerador durante varios meses.
Abstract
La PCR en tiempo real (qPCR) es una técnica notablemente sensible y precisa que permite amplificar cantidades diminutas de objetivos de ácido nucleico a partir de una multitud de muestras. Se ha utilizado ampliamente en muchas áreas de investigación y ha logrado una aplicación industrial en campos como el diagnóstico humano y la selección de rasgos en cultivos de organismos genéticamente modificados (OGM). Sin embargo, la qPCR no es una técnica a prueba de errores. La mezcla de todos los reactivos en una sola mezcla maestra distribuida posteriormente en 96 pocillos de una placa de qPCR regular podría dar lugar a errores del operador, como la mezcla incorrecta de reactivos o la dispensación inexacta en los pozos. Aquí, se presenta una técnica llamada gelificación, mediante la cual la mayor parte del agua presente en la mezcla maestra es sustituida por reactivos que forman una mezcla sol-gel cuando se somete al vacío. Como resultado, los reactivos de qPCR se conservan eficazmente durante algunas semanas a temperatura ambiente o unos pocos meses a 2-8 oC. Los detalles de la preparación de cada solución se muestran aquí junto con el aspecto esperado de una reacción gelificada diseñada para detectar ADN satélite de T. cruzi (satDNA). Se puede aplicar un procedimiento similar para detectar otros organismos. Iniciar una serie de qPCR gelificada es tan simple como sacar la placa del refrigerador, agregar las muestras a sus respectivos pocillos y comenzar la corrida, disminuyendo así el tiempo de configuración de una reacción de placa completa al tiempo que lleva cargar las muestras. Además, las reacciones de PCR gelificadas se pueden producir y controlar para determinar la calidad en lotes, ahorrando tiempo y evitando errores comunes del operador mientras se ejecutan las reacciones de PCR de rutina.
Introduction
La enfermedad de Chagas fue descubierta a principios delsiglo XX en las regiones rurales de Brasil, donde la pobreza era generalizada 1,2. Incluso hoy en día, la enfermedad sigue estando conectada a los determinantes sociales y económicos de la salud en las Américas. La enfermedad de Chagas es bifásica, comprendiendo una fase aguda y otra crónica. Es causada por infección por el parásito Trypanosoma cruzi, siendo transmitida por insectos vectores, transfusiones de sangre por vía congénita o ingestión oral de alimentos contaminados 3,4.
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas puede realizarse mediante la observación de síntomas clínicos (especialmente el signo de Gaña), microscopía de frotis de sangre, serología y pruebas moleculares como PCR en tiempo real (qPCR) o amplificación isotérmica 4,5,6,7,8,9. Los síntomas clínicos y la microscopía de frotis de sangre se utilizan en casos sospechosos de infecciones agudas, mientras que la búsqueda de anticuerpos se utiliza como una herramienta de detección en pacientes asintomáticos. Debido a su sensibilidad y especificidad, se ha sugerido que la qPCR sea utilizada como una herramienta de monitoreo para pacientes crónicos, para pacientes agudos sometidos a tratamiento que mide la carga del parásito en la sangre y como un marcador sustituto de fracaso terapéutico 6,8,10,11,12 . Aunque más sensible y específica que las pruebas disponibles actualmente, la qPCR se evita efectivamente de ser conocida como herramientas de diagnóstico en regiones desfavorecidas de todo el mundo debido al requisito de temperaturas de congelación para el transporte y almacenamiento13,14,15.
Para sortear este obstáculo, se han explorado técnicas de conservación como la liofilización y la gelificación16,17. Mientras que la liofilización proporciona conservación durante años, requiere reactivos especialmente fabricados sin la presencia de glicerol, que es comúnmente utilizado para la estabilización/conservación de enzimas18. Si bien se ha demostrado que la gelificación proporciona conservación durante meses, permite el uso de reactivos regulares19. La solución de gelificación comprende cuatro componentes, cada uno con funciones específicas en el proceso: los azúcares trehalosa y melezitosa protegen las biomoléculas durante el proceso de desecación al reducir las moléculas de agua libre en la solución, el glucógeno produce una matriz protectora más amplia y el aminoácido lisina se utiliza como eliminador de radicales libres para inhibir las reacciones oxidantes entre el carboxilo de la biomolécula, grupos amino y fosfato. Estos componentes definen una mezcla sol-gel que evita la pérdida de la estructura terciaria o cuaternaria durante el proceso de desecación, ayudando así a mantener la actividad de las biomoléculas tras la rehidratación19. Una vez estabilizadas dentro de los tubos de reacción, las reacciones pueden almacenarse durante unos meses a 2-8 °C o unas semanas a 21-23 °C en lugar de los -20 °C habituales. Este enfoque ya ha sido incorporado en pruebas diseñadas para ayudar a diagnosticar enfermedades como la enfermedad de Chagas, la malaria, la leishmaniasis, la tuberculosis y la ciclosporiasis13,14,15,20.
El presente trabajo describe todos los pasos para preparar las soluciones requeridas para el procedimiento de gelificación, las trampas en el proceso y el aspecto final esperado de una qPCR gelificada lista para usar dentro de tiras de ocho tubos. El mismo protocolo se puede adaptar para tubos individuales o placas de 96 pocillos. Finalmente, la detección de ADN de T. cruzi se mostrará como una ejecución de control.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los últimos años han puesto de relieve la necesidad de encontrar tecnologías más sensibles y específicas para ayudar a diagnosticar enfermedades tropicales y desatendidas. Aunque son importantes para el control epidemiológico, las pruebas parasitológicas (microscopía óptica) y serológicas tienen limitaciones, especialmente con respecto a la sensibilidad y la aplicabilidad en el punto de atención. Las técnicas de amplificación de ADN como la PCR, la amplificación isotérmica y las variaciones respectivas se …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean expresar su agradecimiento a Aline Burda Farias por la asistencia técnica con el horno de vacío, así como a la administración del Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir el acceso a dicho equipo. Este trabajo fue financiado parcialmente por la subvención CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
Riferimenti
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas’s disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas’ disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas’ disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
