Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов
Summary
В настоящей работе описываются этапы получения готовой к использованию qPCR для обнаружения ДНК T. cruzi , которая может быть предварительно загружена в реакционный сосуд и храниться в холодильнике в течение нескольких месяцев.
Abstract
ПЦР в реальном времени (qPCR) является удивительно чувствительным и точным методом, который позволяет амплифицировать мельчайшие количества мишеней нуклеиновых кислот из множества образцов. Он широко используется во многих областях исследований и достиг промышленного применения в таких областях, как диагностика человека и выбор признаков в культурах генетически модифицированных организмов (ГМО). Однако qPCR не является методом защиты от ошибок. Смешивание всех реагентов в одну мастер-смесь, впоследствии распределенную по 96 скважинам обычной пластины qPCR, может привести к ошибкам оператора, таким как неправильное смешивание реагентов или неточное дозирование в скважины. Здесь представлен метод, называемый гелеобразованием, при котором большая часть воды, присутствующей в основной смеси, замещается реагентами, которые образуют золь-гелевую смесь при подаче в вакуум. В результате реагенты qPCR эффективно сохраняются в течение нескольких недель при комнатной температуре или нескольких месяцев при 2-8oC. Детали приготовления каждого растворапоказаны здесь вместе с ожидаемым аспектом гелеобразной реакции, предназначенной для обнаружения спутниковой ДНК T. cruzi (сатДНК). Аналогичная процедура может быть применена для обнаружения других организмов. Запуск гелеобразного запуска qPCR так же прост, как извлечение пластины из холодильника, добавление образцов в соответствующие колодцы и начало запуска, тем самым уменьшая время настройки реакции с полной пластиной до времени, необходимого для загрузки образцов. Кроме того, гелеобразные реакции ПЦР могут производиться и контролироваться на качество партиями, экономя время и избегая распространенных ошибок оператора при выполнении рутинных реакций ПЦР.
Introduction
Болезнь Шагаса была обнаружена в начале 20века в сельских районах Бразилии, где бедность была широко распространена 1,2. Даже сегодня болезнь по-прежнему связана с социальными и экономическими детерминантами здоровья в Северной и Южной Америке. Болезнь Шагаса двухфазна, включает в себя острую и хроническую фазы. Он вызван инфекцией паразитом Trypanosoma cruzi, передаваемой насекомыми-переносчиками, переливанием крови врожденным путем или пероральным приемом зараженной пищи 3,4.
Диагностика болезни Шагаса может быть проведена путем наблюдения клинических симптомов (особенно знака Романьи), микроскопии мазка крови, серологии и молекулярных тестов, таких как ПЦР в реальном времени (qPCR) или изотермическая амплификация 4,5,6,7,8,9. Клинические симптомы и микроскопия мазка крови используются при подозрении на острые инфекции, в то время как поиск антител используется в качестве инструмента скрининга у бессимптомных пациентов. Из-за своей чувствительности и специфичности qPCR было предложено использовать в качестве инструмента мониторинга для хронических пациентов, для острых пациентов, проходящих лечение, измеряя паразитарную нагрузку в крови, и в качестве суррогатного маркера терапевтической недостаточности 6,8,10,11,12 . Несмотря на то, что qPCR является более чувствительным и специфическим, чем имеющиеся в настоящее время тесты, он фактически не может быть известен как диагностические инструменты в неблагополучных регионах по всему миру из-за требования низких температур для транспортировки и хранения 13,14,15.
Чтобы обойти это препятствие, методы сохранения, такие как лиофилизация и гелеобразование, были изучены16,17. В то время как лиофилизация обеспечивает сохранение в течение многих лет, она требует специально изготовленных реагентов без присутствия глицерина, который обычно используется для стабилизации / сохранения ферментов18. Хотя было показано, что гелеобразование обеспечивает сохранение в течение нескольких месяцев, оно позволяет использовать обычные реагенты19. Раствор для гелеобразования содержит четыре компонента, каждый из которых играет определенную роль в процессе: сахара трегалоза и мелезитоза защищают биомолекулы в процессе высыхания, уменьшая молекулы свободной воды в растворе, гликоген производит более широкую защитную матрицу, а аминокислота лизин используется в качестве поглотителя свободных радикалов для ингибирования реакций окисления между карбоксилом биомолекулы, амино- и фосфатные группы. Эти компоненты определяют золь-гелевую смесь, которая предотвращает потерю третичной или четвертичной структуры в процессе высыхания, тем самым помогая поддерживать активность биомолекул при регидратации19. После стабилизации внутри реакционных трубок реакции могут храниться в течение нескольких месяцев при 2-8 °C или нескольких недель при 21-23 °C вместо обычных -20 °C. Этот подход уже был включен в тесты, предназначенные для диагностики таких заболеваний, как болезнь Шагаса, малярия, лейшманиоз, туберкулез и циклоспориаз 13,14,15,20.
Настоящая работа описывает все этапы подготовки необходимых растворов для процедуры гелеобразования, подводные камни в процессе и ожидаемый конечный аспект готовой к использованию гелеобразной qPCR внутри восьмитрубных полосок. Тот же протокол может быть адаптирован для одиночных труб или плит с 96 скважинами. Наконец, обнаружение ДНК T. cruzi будет показано как контрольный запуск.
Protocol
Representative Results
Discussion
Последние годы подчеркнули необходимость поиска более чувствительных и специфических технологий, помогающих диагностировать тропические и забытые болезни. Несмотря на важность эпидемиологического контроля, паразитологические (оптическая микроскопия) и серологические тесты имеют ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить благодарность Алин Бурда Фариас за техническую помощь с вакуумной печью, а также администрации Института молекулярной биологии Параны (IBMP, Куритиба, Бразилия) за предоставление доступа к указанному оборудованию. Эта работа была частично профинансирована грантом CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
Riferimenti
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas’s disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas’ disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas’ disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
