Summary

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

Published: December 28, 2021
doi:

Summary

בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס החלבון INAD, בפרוטוקול זה פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה משופרת בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני Drosophila .

Abstract

פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה היא אחד ממסלולי האיתות המצומדים לחלבון G המהירים ביותר הידועים. כדי להבטיח את הספציפיות והיעילות של מפל זה, תעלת הקטיון החדירה של הסידן (Ca2+), פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP), נקשרת בחוזקה לחלבון הפיגום, D (INAD) ללא הפסקה-ללא-אחרי-פוטנציאל, ויוצרת קומפלקס גדול של חלבון איתות עם חלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC) ופוטנציאל פוספוליפאז Cβ/No קולטן A (PLCβ/NORPA). עם זאת, התכונות הביוכימיות של ערוץ ה- TRP של דרוזופילה עדיין אינן ברורות. בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD, פותחה אסטרטגיית טיהור זיקה שונה בתוספת אסטרטגיית תחרות כדי לטהר את ערוץ ה- TRP האנדוגני. ראשית, שבר ההיסטידין המטוהר (שלו) מתויג NORPA 863-1095 נקשר לחרוזי Ni ושימש כפיתיון למשיכת קומפלקס חלבון INAD אנדוגני מראש דרוזופילה הומוגנטים. לאחר מכן, גלוטתיון S-transferase (GST) מטוהר יתר על המידה מתויג TRP 1261-1275 קטע נוסף ל- Ni-beads כדי להתחרות בערוץ TRP. לבסוף, תעלת ה-TRP בסופר-נטנט הופרדה מהפפטיד המוגזם TRP 1261-1275 על ידי כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל. שיטה זו מאפשרת לחקור את מנגנון הגטינג של תעלת ה-TRP Drosophila מזוויות ביוכימיות ומבניות כאחד. את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלות TRP דרוזופילה מטוהרות ניתן למדוד גם בעתיד.

Introduction

פוטו-טרנסדוקציה היא תהליך שבו פוטונים נספגים מומרים לקודים חשמליים של נוירונים. הוא מעביר באופן בלעדי אופסינים ואת מפל האיתות המצומד לחלבון G הבא הן אצל בעלי חוליות והן אצל חסרי חוליות. ב-Drosophila, על-ידי שימוש בחמשת תחומי ה-PDZ שלה, פיגום חלבון ההשבתה-ללא-אחרי-פוטנציאל D (INAD) מארגן קומפלקס איתות סופראמולקולרי, המורכב מתעלת פוטנציאל קולטן חולף (TRP), פוספוליפאז Cβ/ללא פוטנציאל קולטן A (PLCβ/NORPA), וחלבון קינאז C ספציפי לעין (ePKC)1. היווצרותו של קומפלקס איתות סופראמולקולרי זה מבטיחה לוקליזציה תת-תאית נכונה, יעילות גבוהה וספציפיות של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. בקומפלקס זה, ערוצי TRP רגישים לאור פועלים כאפקטים במורד הזרם של NORPA ומתווכים את זרם הסידן ואת הדה-פולריזציה של פוטורצפטורים. מחקרים קודמים הראו כי פתיחת ערוץ ה-TRP של דרוזופילה מתווכת על ידי פרוטונים, שיבוש של סביבת השומנים המקומית או כוח מכני 2,3,4. ערוץ ה- TRP של Drosophila מקיים אינטראקציה גם עם calmodulin5 ומווסת על ידי סידן על ידי משוב חיובי ושליליכאחד 6,7,8.

עד כה, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים על מנגנון הגידור של תעלות Drosophila TRP ו-TRP דמויות TRP (TRPL) התבססו על טלאי ממברנה שנכרתה, הקלטות של תאים שלמים מפוטורצפטורים מסוג Drosophila מסוג פרא מנותקים, ותעלות הטרו-ביטוי בתאי S2, SF9 או HEK 2,9,10,11,12,13, אך לא בערוצים מטוהרים. גם המידע המבני של ערוץ ה-TRP Drosophila באורך מלא עדיין אינו ברור. על מנת לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של חלבון מטוהר בסביבת ממברנה משוחזרת ולקבל מידע מבני של תעלת ה- Drosophila TRP באורך מלא, קבלת תעלות TRP מטוהרות באורך מלא היא הצעד הראשון הנחוץ, בדומה למתודולוגיות המשמשות במחקרי תעלות TRP של יונקים 14,15,16,17.

לאחרונה, בהתבסס על מנגנון ההרכבה של קומפלקס חלבוני INAD 18,19,20, פותחה לראשונה אסטרטגיית טיהור זיקה בתוספת תחרות כדי לטהר את תעלת ה-TRP מהומוגנטים של ראש דרוזופילה על ידי חרוזי סטרפטווידין 5. בהתחשב בקיבולת הנמוכה ובהעלות היקרה של חרוזי סטרפטווידין, מוצג כאן פרוטוקול טיהור משופר המשתמש בחלבון הפיתיון המתויג שלו ובחרוזי Ni תואמים בעלות נמוכה עם קיבולת גבוהה בהרבה. השיטה המוצעת תסייע לחקור את מנגנון ה-gating של תעלת ה-TRP מזוויות מבניות ולמדוד את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלת ה-TRP באמצעות חלבונים מטוהרים.

Protocol

1. טיהור מקטעי TRP המתויגים ב-GST ושברי NORPA המתויגים שלו לטהר את שבר TRP 1261-1275 המתויג ב-GST הפוך את pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 פלסמיד10 לתאי Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) באמצעות שיטת התמרת הלם חום CaCl2 21. לחסן מושבה בודדת ב 10 מ”ל של לוריא ברטאני בינוני (LB) ולגדול בן ליל?…

Representative Results

במאמר זה, שיטת טיהור חלבונים מוכחת כדי לטהר את ערוץ ה-TRP האנדוגני Drosophila (איור 1). ראשית, ביטוי וטיהור חלבונים רקומביננטיים מיושמים כדי להשיג את הפיתיון ואת החלבונים המתחרים. לאחר מכן, מקטע TRP 1261-1275 המתויג ב-GST מבוטא בתאי E. coli BL21 (DE3) במדיום LB ומטוהר באמצע?…

Discussion

INAD, המכיל חמישה תחומי PDZ, הוא מארגן הליבה של מכונות פוטו-טרנסדוקציה של דרוזופילה. מחקרים קודמים הראו כי INAD PDZ3 נקשר לזנב מסוף C של ערוץ TRP עם ספציפיות מעודנת (KD = 0.3 μM)18. INAD PDZ45 טנדם מקיים אינטראקציה עם שבר NORPA 863-1095 עם זיקת קשירה גבוהה במיוחד (KD = 30 ננומטר). ממצאים אלה מ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘31870746), מענקי מחקר בסיסיים של שנזן (JCYJ20200109140414636), והקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס ‘2021A1515010796) ל- W. L. אנו מודים ל-LetPub (www.letpub.com) על עזרתה הלשונית במהלך הכנת כתב יד זה.

Materials

Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

Riferimenti

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscienze. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Play Video

Citazione di questo articolo
Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

View Video