Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Les caspases sont une famille de protéases d’aspartate de cystéine qui peuvent être regroupées en caspases initiatrices et caspases bourreaux. Les caspases de bourreau comprennent les caspases-3, -6 et -7. Ils se trouvent naturellement dans les cellules sous forme de dimères et sont clivés par les caspases initiatrices pour exécuter l’apoptose¹. Les caspases initiatrices comprennent les caspases humaines-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 et -12. On les trouve sous forme de zymogènes inactifs (pro-caspases) qui sont activés par la dimérisation induite par la proximité et stabilisés par le clivage auto-protéolytique ^2,3. Les caspases inflammatoires sont un sous-ensemble des caspases initiatrices² et englobent les caspases-1, -4, -5 et -12 chez l’homme, et les caspases-1, -11 et -12 chez la souris ^4,5. Plutôt qu’un rôle apoptotique, ils jouent un rôle central dans l’inflammation. Ils intermétrent le traitement protéolytique et la sécrétion de pro-interleukine (IL)-1β et pro-IL-18 ^6,7, qui sont les premières cytokines à être libérées en réponse à des envahisseurs pathogènes ^8,9. Caspase-1 est activé lors du recrutement sur sa plateforme d’activation ; un complexe protéique de grand poids moléculaire appelé inflammasome (Figure 1A)¹⁰. La dimérisation des caspase-4, -5 et -11 se produit indépendamment de ces plates-formes par une voie inflammasome non canonique^11,12.

Les inflammasomes canoniques sont des complexes protéiques multimériques cytosoliques constitués d’une protéine de capteur d’inflammasome, de la protéine adaptatrice ASC (protéine de type mouchette associée à l’apoptose contenant un CARD) et de la protéine effectrice caspase-1¹⁰. Les inflammasomes canoniques les mieux étudiés sont la famille de récepteurs de type NOD contenant un domaine pyrin (NLRP), NLRP1 et NLRP3, la famille NLR contenant un CARD (NLRC), NLRC4 et l’absent dans le mélanome 2 (AIM2). Ils contiennent chacun un domaine pyrine, une CARTE ou les deux domaines. Le domaine CARD sert de médiateur à l’interaction entre les caspases contenant card et leurs activateurs en amont. Par conséquent, la molécule d’échafaudage ASC, qui est composée d’un domaine de pyrine N-terminal (PYD) et ^d’un motif CARD C-terminal ^13,14, est nécessaire pour le recrutement de la caspase-1 dans les inflammasomes NLRP1¹⁰, NLRP3¹⁵ et AIM2¹⁶.

Chaque inflammasome est nommé d’après sa protéine de capteur unique qui reconnaît des stimuli pro-inflammatoires distincts (Figure 1B). Les activateurs de cette voie sont appelés stimuli canoniques. Les inflammasomes servent de capteurs pour les composants microbiens et le stress tissulaire, et s’assemblent pour déclencher une réponse inflammatoire robuste par l’activation des caspases inflammatoires¹⁷. L’assemblage d’inflammasomes initie l’activation de la caspase-1 pour médier la maturation et la sécrétion de ses principaux substrats pro-IL-1β et pro-IL-18. Ce processus se produit via un mécanisme en deux étapes. Tout d’abord, un stimulus d’amorçage régule à la hausse l’expression de certaines protéines inflammasomes et pro-IL-1β par l’activation de la voie NF-κB. Deuxièmement, un stimulus intracellulaire (canonique) induit l’assemblage et le recrutement d’inflammasomes de procaspase-1 ^6,7.

Caspase-4 et caspase-5 sont les orthologues humains de la caspase-11-11 murine. Ils sont activés de manière indépendante de l’inflammasome par le lipopolysaccharide intracellulaire (LPS), une molécule présente dans la membrane externe de la bactérie Gram négatif ^18,19,20, et par l’hème extracellulaire, un produit de l’hémolyse des globules rouges²¹. Il a été proposé que le LPS se lie directement au motif CARD de ces protéines et induit leur oligomérisation²⁰. L’activation de la caspase-4 ou de la caspase-5 favorise la libération d’IL-1β en induisant une forme inflammatoire de mort cellulaire appelée pyroptose par clivage de la protéine formant des pores gasdermine D (GSDMD)^18,19. De plus, l’efflux d’ions potassium résultant de la mort pyroptotique médiée par la caspase-4 et la GSDMD induit l’activation de l’inflammasome NLRP3 et l’activation ultérieure de la caspase-1^22,23. Par conséquent, les caspases-4, -5 et -11 sont considérées comme des capteurs intracellulaires pour le LPS capables d’induire la pyroptose et l’activation de la caspase-1 en réponse à des stimuli spécifiques^11,24.

Figure 1 : Caspases inflammatoires et test de complémentation de fluorescence caspase-bimoléculaire (BiFC). (A) Diagramme montrant le système caspase-BiFC, où deux prodomaines de caspase-1 (C1-pro) liés à chaque fragment non fluorescent de Vénus (Vénus-C ou Vénus-N) sont recrutés sur la plate-forme d’activation NLRP3, forçant Vénus à se replier et à fluorescence. Ce complexe apparaît comme une tache verte au microscope et sert de lecture pour la proximité inflammatoire induite par la caspase, qui est la première étape de l’activation de la caspase initiatrice. (B) Schéma montrant l’organisation du domaine des composants inflammasomes et des caspases inflammatoires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Il est difficile de mesurer l’activation des caspases initiatrices spécifiques, et il n’existe pas beaucoup de méthodes disponibles pour le faire par des approches d’imagerie. La complémentation par fluorescence bimoléculaire de caspase (BiFC) peut être utilisée pour visualiser l’activation inflammatoire de la caspase directement dans les cellules vivantes (Figure 1A)²⁵. Cette technique a été récemment adaptée pour être utilisée dans les macrophages dérivés de monocytes humains (MDM)²¹. Caspase BiFC mesure la première étape de l’activation inflammatoire de la caspase, la proximité induite pour faciliter la dimérisation. L’expression de plasmides codant pour le prodomaine de caspase contenant du CARD fusionné à des fragments non fluorescents de la protéine fluorescente jaune photostable Vénus (Vénus-C [VC]) et Vénus-N [VN]) est utilisée. Lorsque les deux prodomaines de caspase sont recrutés sur leur plate-forme d’activation ou subissent une proximité induite, les deux moitiés de Vénus sont rapprochées et forcées de se replier et de fluorescence (voir Figure 1A, B). Cela fournit une lecture en temps réel de l’activation spécifique de la caspase inflammatoire.

Les MDM humains expriment abondamment les gènes inflammasomes et les récepteurs de reconnaissance de formes qui identifient les signaux de danger et les produits pathogènes. Cela fournit un type de cellule idéal pour l’interrogation des voies inflammatoires de la caspase. En outre, ils peuvent être dérivés du sang périphérique et même d’échantillons de patients pour évaluer l’activation de la caspase inflammatoire dans un état pathologique spécifique. Ce protocole décrit comment introduire les rapporteurs de caspase BiFC dans le MDM en utilisant la nucléofection, une méthode de transfection basée sur l’électroporation, comment traiter les cellules pour induire l’activation inflammatoire de la caspase et comment visualiser les complexes de caspase actifs à l’aide d’approches microscopiques. De plus, cette méthodologie peut être adaptée pour déterminer la composition moléculaire de ces complexes, la localisation subcellulaire, la cinétique et la taille de ces structures hautement ordonnées 25,26,27.