DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה
Summary
DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.
Abstract
סינפסות הן אתר התקשורת בין נוירונים. חוזק המעגל העצבי קשור לצפיפות הסינפטית, והתפרקות הסינפסות אופיינית למצבי מחלה כמו הפרעת דיכאון מז’ורי (MDD) ומחלת אלצהיימר. טכניקות מסורתיות לחקר מספרי סינפסות כוללות ביטוי גנטי של סמנים פלואורסצנטיים (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)), צבעים הממלאים נוירון (למשל, צבע קרבוציאנין, DiI), וזיהוי אימונופלואורסצנטי של סמני עמוד שדרה (למשל, צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD95)). אזהרה מרכזית לטכניקות פרוקסי אלה היא שהן מזהות רק שינויים פוסט-סינפטיים. עם זאת, סינפסה היא חיבור בין מסוף קדם-סינפטי לבין עמוד שדרה פוסט-סינפטי. תקן הזהב למדידת היווצרות/חיסול סינפסות דורש מיקרוסקופיית אלקטרונים גוזלת זמן רב או טכניקות טומוגרפיה של מערך. טכניקות אלה דורשות הכשרה מיוחדת וציוד יקר. יתר על כן, רק מספר מוגבל של נוירונים ניתן להעריך והם משמשים כדי לייצג שינויים באזור שלם במוח. DetectSyn היא טכניקה פלואורסצנטית מהירה המזהה שינויים בהיווצרות או חיסול סינפסות עקב מצב מחלה או פעילות תרופתית. DetectSyn משתמשת במבחן קשירת קרבה מהיר כדי לזהות חלבונים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מעוותים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, טכניקה הזמינה בקלות לרוב המעבדות. זיהוי פלואורסצנטי של הפנקטה המתקבלת מאפשר ניתוח מהיר ובלתי מוטה של ניסויים. DetectSyn מספקת תוצאות מייצגות יותר ממיקרוסקופיית אלקטרונים מכיוון שניתן לנתח אזורים גדולים יותר מאשר מספר מוגבל של נוירונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, DetectSyn עובד עבור נוירונים בתרבית במבחנה ופרוסות רקמה קבועות. לבסוף, מסופקת שיטה לניתוח הנתונים שנאספו מטכניקה זו. באופן כללי, DetectSyn מציעה הליך לאיתור שינויים יחסיים בצפיפות הסינפסה בין טיפולים או מצבי מחלה, והיא נגישה יותר מטכניקות מסורתיות.
Introduction
סינפסות הן יחידת התקשורת הבסיסית בין נוירונים1. סינפסות רבות בין נוירונים באותם אזורים יוצרות מעגלים המתווכים התנהגות2. סינפסות מורכבות ממסוף קדם-סינפטי מתא עצב אחד המשחרר מוליכים עצביים או נוירופפטידים המעבירים מידע לקולטנים פוסט-סינפטיים של נוירון אחר. הסיכום של אותות קדם-סינפטיים קובע אם הנוירון הפוסט-סינפטי יפעיל פוטנציאל פעולה ויפיץ את המסר לנוירונים אחרים.
סינפטופתולוגיה, פירוק הסינפסות, מתעוררת במחלות ובהפרעות המסומנות בירידה בנפח העצבי, כמו מחלת אלצהיימר והפרעת דיכאון מז’ורי, וכתוצאה מכך מעגלים שכבר אינם מבצעים באופן אופטימלי 3,4,5. שחזור צפיפות הסינפסה ככל הנראה עומד בבסיס היעילות של טיפולים פוטנציאליים להפרעות אלה. לדוגמה, לאחרונה הוכח כי הגדלת הסינפסות עומדת בבסיס היעילות ההתנהגותית של תרופות נוגדות דיכאון מהירות6. כדי לסנן במהירות טיפולים סינפטופתולוגיים אפשריים, חוקרים זקוקים לטכניקות שמזהות במהירות שינויים במספרי הסינפסות.
המתודולוגיות הנוכחיות גוזלות זמן רב ויקרות (מיקרוסקופיית אלקטרונים, טומוגרפיה של מערך), או שהן בוחנות רק שינויים פוסט-סינפטיים מבלי לשלב מעורבות קדם-סינפטית (ניתוח עמוד שדרה, אימונופלואורסצנציה/קולוקליזציה). צבעים כמו DiI או חלבונים פלואורסצנטיים כמו GFP עוזרים לדמיין נוירונים ולאפיין עמודי שדרה פוסט-סינפטיים. עם זאת, ניתוח עמוד השדרה משתמש ביחסים המוגדרים על ידי חוקר כדי לקבוע מורפולוגיה, אשר יכול להפחית את יכולת השכפול7. יתר על כן, האופן שבו שיעורי עמוד השדרה השונים מתייחסים לסינפסות תפקודיות עדיין נחשף8. היווצרות עמוד השדרה יכולה להיות חולפת ועשויה לשקף פלסטיות פוסט-סינפטית, אך ניתן לסלק את הקוצים האלה לפני שהם מתייצבים לסינפסה עם נוירון קדם-סינפטי9.
קולוקליזציה מספקת פרוקסי טוב יותר לסינפסות מאשר ניתוח עמוד שדרה מכיוון שניתן להגן על חיסונים עבור חלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. עם זאת, חלבונים סינפטיים עשויים להניב ערכי קולוקליזציה נמוכים מכיוון שהחלבונים משתלבים זה בזה וייתכן שאינם חופפים באופן עקבי. לפיכך, מכיוון שהחלבונים אינם עליונים לחלוטין, טכניקות קולוקליזציה עשויות שלא למדוד במדויק שינויים בהיווצרות הסינפסה בשל מידע חסר זה. לבסוף, למרות שגם מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) וגם טומוגרפיה של מערך מספקים תמונות ברזולוציה גבוהה של סינפסות, הן גוזלות זמן רב. EM דורש גם ציוד מיוחד, והחוקרים מוגבלים לכמויות קטנות של רקמות עבור כל ניסוי נתון. בעוד שטומוגרפיה של מערך מספקת באלגנטיות את היכולת לסנן חלבונים רבים על מקטעי אולטרה-טווין וניתן לשלב אותה עם EM10, טכניקה זו עשויה להיות עתירת עבודה מדי ומעבר להיקף הניסויים שצריכים לסרוק במהירות אחר שינויים ביצירת סינפסות.
DetectSyn הוא יישום ספציפי של מבחן הליגה של קרבת דואולינק. בדיקת PLA מאפשרת זיהוי כללי של אינטראקציות חלבון-חלבון. DetectSyn מגשר על מדדים פוסט-סינפטיים של פרוקסי על-ידי הגברת אות פלואורסצנטי הנפלט על-ידי חלבונים מתויגים לפני ואחרי-סינפטיים בטווח של 40 ננומטר זה מזה. אם החלבונים הסינפטיים נמצאים בטווח של 40 ננומטר, כמו בתוך שסע סינפטי, אז הנוגדנים המשניים, המכילים בדיקות דנ”א, יתאיימו לדנ”א מעגלי. הדנ”א המעגלי ההיברידי הזה מבטא בדיקה פלואורסצנטית, שלאחר מכן מוגברת ומתגלה באמצעות טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (ראו איור 1). באופן מכריע, שלא כמו EM וטומוגרפיה של מערך, טכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ולוקחת בערך את אותה כמות זמן כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית. הנגישות של טכניקה זו, אם כן, מאפשרת לחוקרים מחוץ למוסדות עתירי מחקר להשתתף במחקר סינאפתולוגי. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לבחון שינויים בצפיפות הסינפטית באזורי מוח מרובים בניסוי אחד, ומציעה ייצוג הוליסטי יותר של שינויים סינפטיים עקב מחלה או טיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn הוא מבחן מהיר המשתמש במבחן קשירת קרבה כדי לזהות חלבונים בטווח של 40 ננומטר זה מזה, מה שמאפשר זיהוי של היווצרות סינפסות. טכניקה זו משפרת את המבחנים הפלואורסצנטיים הנוכחיים, המשמשים רק כמדידות פרוקסי להיווצרות סינפסות. DetectSyn מזהה שינויים הניתנים לכימות בחלבונים סינפטיים הממוקמים בטווח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NINDS R01 NS105005 (KRG) ו- NS105005-03S1 (KRG), משרד ההגנה USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), ומענק ממחקר FRAXA (CFH) ואיגוד האלצהיימר, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Riferimenti
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
