Summary

Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

Published: August 27, 2021
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Abstract

A perda da função dos melanócitos leva ao vitiligo, que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Atualmente, não há tratamento eficaz a longo prazo para o vitiligo. Portanto, é imprescindível desenvolver um tratamento conveniente e eficaz para o vitiligo. A tecnologia de medicina regenerativa para reprogramação direta de células da pele em melanócitos parece ser um novo tratamento promissor do vitiligo. Isso envolve a reprogramação direta das células da pele do paciente em melanócitos funcionais para ajudar a amenizar a perda de melanócitos em pacientes com vitiligo. No entanto, este método precisa ser testado primeiro em camundongos. Embora a reprogramação direta seja amplamente utilizada, não há um protocolo claro para reprogramação direta em melanócitos. Além disso, o número de fatores de transcrição disponíveis é esmagador.

Aqui, um protocolo concentrado do sistema de embalagem de lentivírus é apresentado para produzir fatores de transcrição selecionados para reprogramação de células da pele para melanócitos, incluindo Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. Os fibroblastos embrionários do camundongo (MEFs) foram infectados com o lentivírus concentrado para todos esses fatores de transcrição para a reprogramação direta dos MEFs em melanócitos induzidos (iMels) in vitro. Além disso, esses fatores de transcrição foram examinados, e o sistema foi otimizado para reprogramação direta aos melanócitos. A expressão dos marcadores característicos da melanina em iMels no nível genético ou proteico foi significativamente aumentada. Esses resultados sugerem que a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos pode ser uma nova estratégia terapêutica bem sucedida para o vitiligo e confirmar o mecanismo de desenvolvimento de melanócitos, o que fornecerá a base para uma reprogramação direta de fibroblastos em melanócitos in vivo.

Introduction

O vitiligo é uma doença de pele que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Por várias razões, incluindo anormalidades metabólicas, estresse oxidativo, geração de mediadores inflamatórios, descolamento celular e resposta autoimune, os melanócitos funcionais são perdidos, e a secreção da melanina é interrompida, levando ao desenvolvimento do vitiligo 1,2. Esta condição ocorre amplamente e é particularmente problemática no rosto. O principal tratamento é o uso sistêmico de corticosteroides e imunomoduladores. A fototerapia pode ser usada para doenças sistêmicas ou locais, e há tratamentos cirúrgicos, como transplante de pele perfurado e transplante de melanócitos autólogos 3,4,5. No entanto, pacientes que usam terapia medicamentosa e fototerapia são propensos a recaídas, e esses tratamentos têm efeitos terapêuticos de longo prazo ruins. O tratamento cirúrgico é traumático e apenas moderadamente eficaz 2,6. Portanto, uma nova e eficaz estratégia terapêutica é necessária para o vitiligo.

A reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reverte essas células de seu estado terminal para um estado pluripotente, um processo mediado pelos fatores de transcrição, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. No entanto, devido à possibilidade de tumorigenicidade e ao longo tempo de produção, essa tecnologia tem sido recebida com ceticismo quando aplicada aos cenários clínicos8. Reprogramação direta é uma tecnologia que faz com que um tipo de célula terminal se transforme em outro tipo de célula terminal9. Esse processo é alcançado por fatores adequados de transcrição. Várias células já foram diretamente reprogramadas com sucesso, incluindo cardiomiócitos10, neurônios11 e células ciliadas cocleares12. Alguns pesquisadores até reprogramaram tecido da pele diretamente in situ, que pode ser usado para reparação de feridas13. As vantagens da reprogramação direta incluem redução do tempo de espera e custos, menor risco de câncer, menos problemas éticos e uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à determinação do destinocelular 9.

Embora o método de reprogramação direta seja amplamente utilizado, atualmente não há um método definido para a reprogramação direta das células da pele em melanócitos, especialmente por causa dos numerosos fatores de transcrição a serem considerados14,15. Os fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e Pax3, têm sido usados para reprogramação direta de células da pele em melanócitos14. Em contraste, a combinação de MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 também tem sido usada para reprogramação direta de células da pele em melanócitos humanos em outro estudo15. Neste protocolo, apesar do uso de um método de triagem diferente, o mesmo resultado foi obtido com a combinação de Mitf, Sox10 e Pax3 para reprogramação direta de células da pele em melanócitos como descrito anteriormente14. Desenvolver um sistema para gerar melanócitos de outras células da pele pode fornecer um esquema para transformar outras células da pele de pacientes com vitiligo em melanócitos. Por isso, é fundamental construir um método simples e eficiente para essa reprogramação direta para gerar melanócitos com sucesso.

Protocol

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Gestão e Uso de Animais laboratoriais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC-AP-20190305010). Os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC International). Não houve experimentos envolvendo humanos, por isso este trabalho não precisava de aprovação do comitê de ética em pesquisa humana. Consulte a Tabela de Materiais par…

Representative Results

Este artigo inclui os protocolos de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para produzir lentivírus de fatores de transcrição para reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos e protocolos para triagem de fatores de transcrição e reprogramação direta de melanócitos de MEFs. O sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência de GFP (Figura 1A) ou por citometria de fluxo (<strong…

Discussion

A qualidade do vírus é crucial para o sucesso da reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo. O método de embalar e concentrar vírus neste protocolo é simples e fácil de repetir e não conta com nenhum outro reagente concentrado auxiliar. Este protocolo pode ser seguido com sucesso na maioria dos laboratórios. Para garantir a qualidade do vírus concentrado, os seguintes pontos precisam de atenção especial. Um deles é o estado celular do HEK-293T. Embora as células HEK-293T sejam células imortaliz…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi parcialmente apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (82070638 e 81770621) e da Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20180281).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-062 Stored at -20 °C
0.45 μM filter Millipore SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube Falcon 352052
95%/100% ethanol LANBAO 210106 Stored at RT
Adenine Sigma A2786 Stock concentration 40 mg/mL
Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a Invitrogen A21137 Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep) Gibco 15140-122 Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody Millipore MABC592 Host/Isotype: Mouse IgG2a
Species reactivity: Mouse/Human
Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody Abcam ab74073 Host/Isotype: Rabbit IgG
Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Stock concentration 10 mM
Final concentration 3 μM
Cholera toxin Sigma C8052 Stock concentration 0.3 mg/mL
Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 111-165-144 Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose) HyClone SH30243.01 Stored at 4 °C
DMSO  Sigma D2650 Stored at RT
FBS Gibco 10270-106 Stored at -20 °C
Heat-inactivated before use
Gelatin Sigma G9391 Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) Hanheng Biological Technology Co., Ltd. pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 Stored at -20 °C
Hematoxylin Abcam ab220365 Stored at RT
Human EDN3 American-Peptide 88-5-10A Stock concentration 100 μM
Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 µg/mL
Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA Sigma D9628 Stored at RT
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit Solarbio G2032 Stored at 4 °C
Neutral balsam Solarbio G8590 Stored at 4 °C
Paraformaldehyde Sigma P6148 Stored at RT
PBS (-) Gibco C10010500BT Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) Sigma P8139 Stock concentration 1 mM
Final concentration 200 nM
Polybrene Sigma H9268 cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL
Final concentration 4 ng/µL
Puromycin Gibco A11138-03 Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF Invitrogen 13256-029 Stock concentration 4 μg/mL
Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin Sigma  I3536 Stock concentration 10 mg/mL
Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF R&D 255-SC-010 Stock concentration 200 μg/mL
Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640 Gibco 11875-093 Stored at 4 °C
Xylene Sigma 1330-20-7 Stored at RT

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Zhang, Y., Liu, L., Jin, M., Sun, H., Zhang, H., Li, Y. Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (174), e62911, doi:10.3791/62911 (2021).

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