הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס
Summary
עמודי שדרה דנדריטים הם מאפיינים תאיים חשובים של מערכת העצבים. כאן מתוארות שיטות הדמיה חיות להערכת המבנה והתפקוד של קוצים דנדריטיים ב – C. elegans. גישות אלה תומכות בפיתוח מסכים מוטנטיים לגנים המגדירים צורה או תפקוד של עמוד שדרה דנדריטי.
Abstract
קוצים דנדריטיים הם אתרים מיוחדים של עצבנות סינפטית המווסתת על ידי פעילות ומשמשים כמצעים ללמידה ולזיכרון. לאחרונה, קוצים דנדריטיים תוארו עבור נוירונים DD GABAergic כאתרי קלט של נוירונים כולינרגיים presynaptic במעגל המוטורי של Caenorhabditis elegans. מעגל סינפטי זה יכול כעת לשמש כמודל in vivo חדש ורב עוצמה של מורפוגנזה ותפקוד של עמוד השדרה המנצל את הגנטיקה הפאסילית ואת הנגישות המוכנה של C. elegans להדמיית תאים חיים.
פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות ניסיוניות להערכת המבנה והתפקוד של עמוד השדרה DD. בגישה זו, נעשה שימוש באסטרטגיית הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד כדי להמחיש את הצורות המורכבות של קוצים דנדריטיים עשירים באקטין. כדי להעריך את תפקוד עמוד השדרה DD, האופסין המופעל על ידי אור, Chrimson, מגרה את הנוירונים הכולינרגיים הקדם-סינפטיים, ומחוון הסידן, GCaMP, מדווח על ארעי הסידן המעוררים בקוצים DD פוסט-סינפטיים. יחד, שיטות אלה מרכיבות גישות רבות עוצמה לזיהוי דטרמיננטות גנטיות של קוצים דנדריטיים ב – C. elegans שיכולים גם לכוון את המורפוגנזה של עמוד השדרה ולתפקד במוח.
Introduction
קוצים דנדריטיים הם מבנים תאיים מיוחדים המקבלים קלט מתאי עצב שכנים להעברה סינפטית. הפעלה של קולטני מוליכים עצביים מעלה את מסלולי הסידן והאיתות התוך-תאיים במורד הזרם בבליטות עצביות אופייניותאלה 1. בגלל החשיבות הבסיסית של קוצים דנדריטיים להעברה עצבית והרגולציה השגויה שלהם במחלות נוירו-התפתחותיות1, גילוי הגורמים המווסתים את המורפוגנזה והתפקוד של עמוד השדרה הדנדריטי מעניין מאוד את תחום מדעי המוח.
לאחרונה זוהו קוצים דנדריטיים במערכת העצבים C. elegans בהתבסס על מאפיינים מרכזיים המשותפים לקוצים של יונקים2. קביעה זו היא חיונית משום שהיא פותחת את האפשרות לנצל את היתרונות של C. elegans כדי לחקור ביולוגיה של עמוד השדרה. עמודי שדרה דנדריטיים בתאי עצב מוטוריים מסוג Dorsal D (DD) מקבלים קלט מנוירונים כולינרגיים (VA ו-VB) בחוט העצב הגחוני (איור 1A)2,3,4. כאן מוצגות שיטות הדמיה כדי לחקור את המבנה של קוצים דנדריטיים DD ואת תפקודם in vivo במערכת עצבים שלמה הנגישה בקלות להדמיה חיה ולניתוח גנטי. לניטור צורת הקוצים הדנדריטיים, (1) חלבונים פלואורסצנטיים ציטוזוליקים, הממלאים את התהליך הדנדריטי ואת עמודי השדרה; (2) חלבונים פלואורסצנטיים הקשורים לממברנה, המעטרים את גבול הקוצים הדנדריטים והדנדריטים; או (3) נעשה שימוש בסמני האטין, LifeAct5 או Utrophin6, המועשרים בעמוד השדרה הדנדריטי, ובכך לחשוף את צורתם. כדי לנטר את הפונקציונליות של קוצים DD, נעשה שימוש בפלואורסצנציה של GCaMP כדי לזהות ארעי Ca++ המעוררים על ידי הפעלת האופסין המוסט אדום, כרימזון, בנוירונים כולינרגיים קדם-סינפטיים7. שתי האסטרטגיות צפויות להקל על חקר עמוד השדרה הדנדריטי DD בחיות בר ומוטנטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
גלאי Airyscan נבחר כדי לקבל תמונות של קוצים DD מכיוון שהוא מעניק יחס אות לרעש גבוה יותר ורזולוציה טובה יותר מאשר מיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים19,20. הדמיית AiryScan מאפשרת גם שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים קונבנציונליים (למשל, GFP, mCherry וכו’), הזמינים כיום באופן נרחב עבור C. elegans. למרות שניתן להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר בשיטות אחרות ברזולוציה גבוהה יותר (למשל, STORM, STED, PALM), שיטות אלה דורשות חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים להפעלה או לפוטו-מתג21. כחלופה ל- Airyscan, מומלץ מיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים. לדוגמה, הדמיה עם רכישת Nyquist (איור 3) משיגה את גודל הפיקסלים באמצעות מטרה של 40x/1.3 של 123.9 ננומטר, מספיק כדי להבחין בין הסוגים המורפולוגיים של עמוד השדרה (איור 2).
לקביעת צפיפות עמוד השדרה, מומלץ להשתמש בחלבון פלואורסצנטי ציטוזולי כגון (1) mCherry או GFP, (2) LifeAct כדי לסמן את שלד האקטין הציטוסקנטי, או (3) חלבון פלואורסצנטי מיריסטוילאט (לדוגמה, MYR::mRuby) כדי לסמן את קרום הפלזמה (איור 1B). לשם השוואה, החלבון הקושר F-actin Utrophin מפחית את צפיפות עמוד השדרה (איור 1C), מה שמצביע על השפעה שלילית על מורפוגנזה של עמוד השדרה כאשר Utrophin מתבטא יתר על המידה.
שיטות ההדמיה הנוכחיות אמורות לסייע בזיהוי וריאנטים גנטיים השולטים במורפולוגיה של עמוד השדרה 1,16. ניתן להעריך את המורפולוגיה של עמוד השדרה DD (כלומר, דק/פטריות, פילופודיאליות, סתמיות, מסועפות, ראו איור 2) מהקרנות דו-ממדיות בודדות של התמונות הצדדיות של חוט העצב הגחוני מאחר שרוב עמודי השדרה של DD מאמצים כיוון גחון אופייני. בהשוואות אלה, חיוני להשתמש באותו סמן פלואורסצנטי עבור כל מצב, שכן נראה כי סוגים מורפולוגיים של עמוד השדרה לכאורה מושפעים משיטת התיוג (למשל, MYR::mRuby vs. חוק החיים::GFP). בנוסף, צוין כי צורות עמוד השדרה הן דינמיות וככל הנראה משנות את צורתן בתגובה לאותות החיצוניים 2,16. לכן, חיוני גם להשוות את צורות עמוד השדרה בין גנוטיפים בשלבי התפתחות דומים ובתנאים דומים.
הכיוון של כבל הגחון C. elegans חיוני ביותר לרכישת תמונה מדויקת. גם החוט הגחוני וגם החוט הגבי בצדדים מנוגדים של החיה אמורים להיות גלויים באותו מישור Z, מה שמצביע על כך שהתולעת מכוונת על צדה (איור 1B). עדיף לא לאסוף תמונות של תולעים נעות או במגע עם תולעים או בועות אחרות ליד כבל הגחון, שכן זה יכול להשפיל תמונות של קוצים.
להדמיית סידן in vivo , יש להכין שקופיות טריות מיד לפני כל רכישה. עדיף לדמות תולעים במגע עם סיבי דבק דקים בלבד לעומת “גושים” של דבק שנוטים לייבש תולעים ולהשפיל את התמונה (איור 4B). בניסוי שמוצג באיור 4, הפולס של אור בגודל 561 ננומטר מפעיל את כל שדה הראייה. להגדלת הרזולוציה הטמפורלית והמרחבית כדי לזהות ארעי Ca++ מקומיים, לדוגמה, בתוך קוצים בודדים של DD, ניתן להשתמש בסורק גלבו מיני המוגדר עבור קו הלייזר של 561 ננומטר כדי לעורר אזור עניין קטן יותר17.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הדמיה וניתוח על Imaris בוצעו במשאב המשותף להדמיית תאים של ונדרבילט (CIRS) הנתמך על ידי NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 ו- EY08126). LSM 880 נתמך על ידי מענק 1S10OD201630. הדמיה בדיסק מסתובב של Nikon בוצעה במרכז המצוינות של Nikon. אנו מודים לג’ני שפר, מנהלת CISR, ולבריאן מיליס על ההכשרה והדיונים מלאי התובנות ולחברי מעבדת ברנט: דילן ברנט, איידן פניקס ונילאי טנג’ה על העצות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות ל- DMM (R01NS081259 ו- R01NS106951) ומענק של איגוד הלב האמריקאי ל- ACC (18PRE33960581).
Materials
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
Riferimenti
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetica. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma – Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist’s guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
