Bu makalede, alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru kullanılarak immünofloresan yoluyla dokulardaki izolevuglandinlerin ölçümü için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Hem farelerde hem de insanlarda hipertansiyon modelleri, doku örneklerinde izolevuglandin ölçümü ile ilişkili adım adım prosedürleri ve temel ilkeleri açıklamak için kullanılır.
İzolevuglandinler (IsoLG’ler), H2-izoprostanlardan lipid peroksidasyonu ve çapraz bağlantı proteinleri yoluyla oluşan, inflamasyona ve hipertansiyon dahil çeşitli hastalıklara yol açan oldukça reaktif gama ketoaldehitleridir. Dokularda IsoLG birikiminin saptanması, hastalık süreçlerine katılımlarına ışık tutmada çok önemlidir. Bununla birlikte, dokulardaki İzoLG’lerin ölçümü son derece zordur ve kütle spektrometresi analizi de dahil olmak üzere şu anda mevcut araçlar zahmetli ve son derece pahalıdır. Burada, alkalen fosfataz konjuge D11 ScFv ve immünofloresan mikroskopi ile E. coli’de üretilen rekombinant faj görüntüleme antikoru kullanılarak dokulardaki İzoLG’lerin yerinde tespiti için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Boyamayı doğrulamak için dört kontrol kullanıldı: (1) D11 ile ve D11 olmadan boyama, (2) alkalen fosfataz bağlayıcı ile bakteriyel periplazmik ekstrakt ile boyama, (3) alakasız scFV antikor boyaması ve (4) boyamadan önce IsoLG ile rekabetçi kontrol. Alkalen fosfataz konjuge D11’in hipertansiyonu olan veya olmayan hem insan hem de fare dokularında etkinliğini gösteriyoruz. Bu yöntem muhtemelen IsoLG’lerin çok çeşitli hastalık süreçlerindeki rolünü incelemek için önemli bir araç olarak hizmet edecektir.
İzoketaller olarak da bilinen İzolevuglandinler (IsoLG’ler), lipit peroksidasyonunun ürünleri olan 4-ketoaldehit ailesinin izomerleridir ve proteinler üzerindeki birincil aminlerle reaksiyona girer ve bunlara katkıda bulunur 1,2. IsoLG’ler kardiyovasküler, Alzheimer, akciğer ve karaciğer hastalıkları ve birçok kanser türü dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir3. IsoLG’ler, Amerika Birleşik Devletleri de dahil olmak üzere küresel olarak önemli bir sağlık ve ekonomik yük olan kardiyovasküler hastalığa (CVD) katkıları konusunda en kapsamlı şekilde incelenmiştir. 92,1 milyon ABD’li yetişkinin en az bir tür CVD’ye sahip olduğu tahmin edilmektedir ve 2030 tahmini projeksiyonları ABD yetişkin nüfusunun% 43,9’una ulaşmaktadır4. Kan basıncını, kolesterolü ve sigarayı bırakmayı düşürmek, CVD olaylarının genel riskini ve oluşumunu azaltır5.
Yüksek tansiyon veya hipertansiyon, kardiyovasküler hastalık için önemli bir risk faktörüdür ve ABD nüfusunun yaklaşık yarısınıetkiler6. Önceki çalışmalar, inflamasyonun hipertansiyonun altında yatan bir neden olduğunu ve IsoLG’lerin bir rol oynadığını bulmuştur7. Anjiyotensin II, katekolaminler, aldosteron ve aşırı diyet tuzu dahil olmak üzere hipertansif uyaranlar, dendritik hücreler (DC’ler) dahil olmak üzere antijen sunan hücrelerde IsoLG birikimini indükler, bu da T hücrelerini hipertansiyona katkıda bulunan inflamatuar sitokinleri çoğaltmak ve üretmek için aktive eder 8,9.
Daha önce, IsoLG’ler immünohistokimya, kütle spektrometrisi, enzime bağlı immünosorbent testi ve akış sitometrisi10,11 ile ölçülmüştür. IsoLG’lerin ölçümünü kolaylaştırmak için, IsoLG’ler12’ye karşı tek zincirli bir fragman değişkeni (scfv) rekombinant antikoru (D11) geliştirilmiştir. Başlangıçta, bu D11 antikoru 11 amino asit E-etiketi içeriyordu ve immünohistokimya tespiti için ikincil bir antikor gerektiriyordu11. Bununla birlikte, üretici tarafından üretiminin durdurulmasından sonra E-etikete karşı güvenilir bir ikincil antikor bulmak zordu. Bu nedenle, hipertansiyonlu ve hipertansiyonsuz fare ve insan dokularında gösterdiğimiz alkalen fosfataz (D11-AP) ile konjuge edilmiş D11 kullanarak IsoLG’lerin immünofloresan boyanması için güvenilir bir protokol geliştirdik.
D11, hücrelerde veya dokularda IsoLG-katkılı proteinleri 8,9,20 hastalığında inflamasyon veya oksidatif stres için bir belirteç olarak tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Önceden, D11 bir E etiketi içeriyordu ve IHC gelişimi, HRP10,20,21 ile konjuge edilmiş ikincil bir anti-E etiket antikorunun kullanılmasını gerektiriyordu. Burada, ikincil bir antikor inkübasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldıran E-tag yerine alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 antikoru kullanarak IsoLG-katkılı proteinlerin tespiti için protokol geliştirdik ve optimize ettik.
D11-AP’nin özgüllüğünü belirlemek için dört negatif kontrol deneyi yapıldı. Protokolü D11 olmadan uyguladık ve minimal gelişme gösterdik. Bu sonuçların iki yönlü bir endikasyonu vardır: endojen alkalen fosfataz gelişime katkıda bulunmaz ve gözlenen lekelenme D11’e bağlıdır ve başka bir katkıda bulunan faktör değildir. Ardından, slaytları D11 olmadan AP bağlayıcı ile boyadık. Bu deney, serbest AP veya periplazmik ekstrakttaki diğer faktörlerin D11 varlığında gözlemlediğimiz lekeye neden olmadığını gösteren çok az lekelenme ile sonuçlandı. D11’in IsoLG’ye özgüllüğünü sağlamak için, slaytları boyamadan önce D11-AP’yi saflaştırılmış IsoLG ile önceden inkübe ettik. D11-AP’nin IsoLG proteinine bağlı olduğunu gösteren gelişimde bir azalma gördük, böylece dokuda bulunan IsoLG’ye bağlanmak için serbest D11-AP miktarını tükettik. Son olarak, D11-AP’nin IsoLG’ye bağlandığından ve MSA proteini IsoLG’nin bağlı olmadığından emin olmak için, D11-AP’yi yalnızca MSA ile önceden inkübe ettik. D11-AP’nin MSA’ya değil, IsoLG proteinine bağlandığını gösteren gelişimde herhangi bir değişiklik olmadı. Son olarak, boyama protokolünü geliştiren araştırmacılar, insan bağırsak dokusunun hipertansif durumuna kördü. Hipertansiyonlu hastalar ile normotansiyonlu hastalar arasında gözlenen boyama farklılıkları önyargıya bağlı değildi ve daha önce22,23 olarak tanımlanmıştı.
E-tag yerine alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 antikoru kullanarak IsoLG-katkılı proteinlerin tespiti için protokolümüz titiz ve sağlam olmasına ve ikincil bir antikor inkübasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırmasına rağmen, bazı sınırlamaları vardır. Bir sınırlama, periplazmik ekstraktta alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 kullanmamız ve periplazmik ekstraktta veya bağırsak24 gibi bazı dokularda endojen alkalen fosfatazın yanlış boyanması olabilir. Bununla birlikte, bu protokolü geliştirmenin ilk adımı, dokularda bulunabilecek endojen alkalen fosfatazın devre dışı bırakılmasını içeriyordu25. Başlangıçta, soğuk asetik asit, BME ve Levamisole26 verimlilik açısından test edildi. Bunların hiçbiri aktif endojen alkalen fosfataz varlığını tamamen azaltmadı. Alkalen fosfataz27’yi devre dışı bırakmak için ısı kullanılmıştır, bu nedenle farklı tamponlarda alkalen fosfatazın ısı deaktivasyonunu test ettik. Sitrat tamponunda ısıtıma monte edilmiş ve hidratlanmış slaytların çoğu endojen alkalen fosfatazı ortadan kaldırdığını bulduk. Slaytlar başlangıçta bir Kemilüminesan / Floresan Substrat kullanılarak geliştirildi, ancak bu substrat olmadan görüntülendiğinde, yüksek miktarda otofloresan vardı. VectorRed, Texas Red / TRITC kanal aralığında görselleştirilebilen bir kromojen üretmek için alkali fosfataz varlığında gelişen bir substrattır. Bu substratı kullanarak, arka plan otofloresansının üzerindeki sinyali daha kolay gözlemleyebildik. Boyama işlemi sırasında yapay lekelenmeyi en aza indirmek için özen gösterilmelidir. Hidrasyondan sonra görüntüleme yapılana kadar slaytlardaki dokuların kurutulması, gelişimin artmasına neden olmuştur. D11-AP alikote edilmeli ve -20 °C’de saklanmalıdır. D11-AP ile çalışırken birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınılmalıdır. Fosfat tamponlu salin (PBS) ayrıca alkali fosfatazın enzimatik aktivitesini de etkileyebilir ve yıkama tamponu28 olarak kullanılmamalıdır. Herhangi bir antikor bazlı yaklaşımda olduğu gibi, boyamanın spesifik olduğundan ve sinyalin fazla veya az yükseltilmediğinden emin olmak için kapsamlı test ve optimizasyon yapılmalıdır.
Sonuç olarak, E-tag yerine alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11 antikoru kullanarak IsoLG-katkılı proteinleri tespit etmek için güçlü, titiz ve sağlam bir optimize edilmiş protokol geliştirdik. Bu protokol birkaç avantaj sunar: İlk olarak, D11’i alkalen fosfataz füzyon proteini olarak kullanmak daha ucuzdur. D11 başlangıçta ticarileştirilemeyen ve saflaştırılması pahalı olan bir faj antikor kütüphanesinden türetilmiştir. E. coli periplazmik ekstraktındaki D11 ucuz bir alternatif sağlayabilmesine rağmen, çoğu tahlilde etkisizdir. İkincisi, alkalen fosfataz füzyon yaklaşımı, D11 scfv’nin kendisine kaynaşmış yararlı bir muhabir15’e (alkalen fosfataz) sahip olmasını sağlar ve substratlar ticari olarak temin edilebildiği için immünotahlillerde kullanılmak üzere saflaştırılmasına gerek kalmaz. Üçüncüsü, E. coli alkalen fosfataz dimerleroluşturur 29. Böylece D11, alkalen fosfataza kaynaştığında dimerler de oluşturur ve bu da antikorun hevesliliğini ve bağlanma aktivitesini arttırır30. Son olarak, periplazmik ekstraktta alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş D11, Cibacron Blue Sepharose kullanılarak kolayca temizlenebilir. D11 yüksek bir izoelektrik noktaya (~ 9.2 pH) sahiptir. Bu nedenle, pozitif yüklüdür ve pi-katyon etkileşimleri yoluyla Cibacron Blue’ya bağlanabilir. E. coli periplazmik ekstraktındaki safsızlıkların çoğu reçineden dışarı atılabilir. Alkalen fosfataz ile konjuge edilen D11 daha sonra suda yüksek tuz (~ 1.5M NaCl) kullanılarak salınabilir. Alkalen fosfataz ile konjuge edilmiş elüe D11, yüksek tuz çözeltisinde 4-8 ° C’de oldukça kararlıdır. Bu nedenle, sadece D11 antikorunu düşük bir maliyetle kullanılabilir hale getirmekle kalmayıp, aynı zamanda ikincil antikor inkübasyonu için ekstra adımları ve ihtiyacı ortadan kaldıran bir protokol geliştirdik. Bu protokol, artan oksidatif stresin rol oynadığı çoklu hastalıklarda dokularda biriken IsoLG’lerin tekrarlanabilir ölçümünü kolaylaştırır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından A.K.’ye K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 ve R03HL155041 hibeleri ile desteklenmiştir. Dijital Histoloji Paylaşılan Kaynağına – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 görselleştirme ve slayt taraması için teşekkür ederiz.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |