Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per la misurazione delle isolevuglandine nei tessuti mediante immunofluorescenza utilizzando l’anticorpo ScFv D11 coniugato con fosfatasi alcalina. I modelli di ipertensione sia nei topi che nell’uomo sono utilizzati per spiegare le procedure passo-passo e i principi fondamentali associati alla misurazione dell’isolevuglandina nei campioni di tessuto.
Le isolevuglandine (IsoLGs) sono chetoaldeidi gamma altamente reattive formate da H2-isoprostani attraverso la perossidazione lipidica e le proteine reticolanti che portano all’infiammazione e a varie malattie tra cui l’ipertensione. Il rilevamento dell’accumulo di IsoLG nei tessuti è fondamentale per far luce sul loro coinvolgimento nei processi patologici. Tuttavia, la misurazione delle IsoLG nei tessuti è estremamente difficile e gli strumenti attualmente disponibili, compresa l’analisi della spettrometria di massa, sono laboriosi ed estremamente costosi. Qui descriviamo un nuovo metodo per la rilevazione in situ di IsoLGs nei tessuti utilizzando ScFv D11 coniugato con fosfatasi alcalina e un anticorpo fagico ricombinante prodotto di E. coli mediante microscopia immunofluorescente. Quattro controlli sono stati utilizzati per convalidare la colorazione: (1) colorazione con e senza D11, (2) colorazione con estratto periplasmatico batterico con il linker della fosfatasi alcalina, (3) colorazione anticorpale scFV irrilevante e (4) controllo competitivo con IsoLG prima della colorazione. Dimostriamo l’efficacia del D11 coniugato con fosfatasi alcalina in tessuti umani e murini con o senza ipertensione. Questo metodo servirà probabilmente come uno strumento importante per studiare il ruolo delle IsoLG in un’ampia varietà di processi patologici.
Le isolevuglandine (IsoLGs), note anche come isochetali, sono isomeri della famiglia delle 4-chetoaldeide, che sono prodotti della perossidazione lipidica e reagiscono e si addotto alle ammine primarie sulle proteine 1,2. Le IsoLG sono state implicate in diverse malattie, tra cui malattie cardiovascolari, Alzheimer, polmonari ed epatiche e molti tipi di cancro3. Le IsoLG sono state ampiamente studiate nel loro contributo alle malattie cardiovascolari (CVD), che è un onere sanitario ed economico significativo a livello globale, compresi gli Stati Uniti. Si stima che 92,1 milioni di adulti statunitensi abbiano almeno un tipo di CVD, con proiezioni stimate per il 2030 che raggiungono il 43,9% della popolazione adulta degli Stati Uniti4. L’abbassamento della pressione sanguigna, del colesterolo e la cessazione del fumo riducono il rischio complessivo e l’insorgenza di eventi CVD5.
L’ipertensione o ipertensione è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari e colpisce circa la metà della popolazione degli Stati Uniti6. Studi precedenti hanno scoperto che l’infiammazione è una causa sottostante dell’ipertensione e che gli IsoLG svolgono un ruolo7. Gli stimoli ipertensivi, tra cui angiotensina II, catecolamine, aldosterone e sale alimentare in eccesso, inducono l’accumulo di IsoLG nelle cellule presentanti l’antigene, comprese le cellule dendritiche (DC), che a loro volta attivano le cellule T per proliferare e produrre citochine infiammatorie che contribuiscono all’ipertensione 8,9.
In precedenza, gli IsoLG sono stati misurati mediante immunoistochimica, spettrometria di massa, saggio immunoassorbente enzimatico e citometria a flusso10,11. Per facilitare la misurazione degli IsoLG, è stato sviluppato un anticorpo ricombinante (D11) a frammento a catena singola (scfv) contro gli IsoLG12. Inizialmente, questo anticorpo D11 conteneva un E-tag di aminoacidi 11 e richiedeva un anticorpo secondario per il rilevamento immunoistochimico11. Tuttavia, è stato difficile trovare un anticorpo secondario affidabile contro l’E-tag dopo l’interruzione della sua produzione da parte del produttore. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo affidabile per la colorazione immunofluorescente di IsoLGs utilizzando D11 coniugato con fosfatasi alcalina (D11-AP), che abbiamo dimostrato in tessuti murini e umani con e senza ipertensione.
D11 è stato ampiamente utilizzato per rilevare le proteine addotto IsoLG in cellule o tessuti come marker per l’infiammazione o lo stress ossidativo nella malattia 8,9,20. In precedenza, D11 conteneva un tag E e lo sviluppo IHC richiedeva l’uso di un anticorpo secondario anti-E tag coniugato con HRP10,20,21. Qui, abbiamo sviluppato e ottimizzato il protocollo per la rilevazione di proteine addotto IsoLG utilizzando l’anticorpo D11 coniugato con fosfatasi alcalina al posto del tag E, che elimina la necessità di un’incubazione anticorpale secondaria.
Per determinare la specificità di D11-AP, sono stati eseguiti quattro esperimenti di controllo negativo. Abbiamo eseguito il protocollo senza la presenza di D11 e abbiamo avuto uno sviluppo minimo. Questi risultati hanno una duplice indicazione: la fosfatasi alcalina endogena non contribuisce allo sviluppo e la colorazione osservata è dovuta a D11 e non a un altro fattore che contribuisce. Successivamente, abbiamo colorato le diapositive con il linker AP senza D11. Questo esperimento ha portato a una piccola colorazione, che indica che l’AP libero o altri fattori nell’estratto periplasmatico non causano la macchia che osserviamo in presenza di D11. Per garantire la specificità di D11 a IsoLG, abbiamo preincubato D11-AP con IsoLG purificato prima di colorare i vetrini. Abbiamo visto una diminuzione dello sviluppo che indica che il D11-AP era legato alla proteina IsoLG, esaurendo così la quantità di D11-AP libero per legarsi a IsoLG presente nel tessuto. Infine, per garantire che D11-AP si legasse a IsoLG e non alla proteina MSA a cui IsoLG era legato, abbiamo preincubato D11-AP solo con MSA. Non ci sono stati cambiamenti nello sviluppo, indicando che D11-AP non si legava alla MSA ma alla proteina IsoLG. Infine, i ricercatori che hanno sviluppato il protocollo di colorazione erano ciechi allo stato ipertensivo del tessuto intestinale umano. Le differenze di colorazione osservate tra pazienti con ipertensione e pazienti con normotensione non erano dovute a distorsioni e sono state descritte in precedenza22,23.
Sebbene il nostro protocollo per la rilevazione delle proteine addotto da IsoLG utilizzando l’anticorpo D11 coniugato con fosfatasi alcalina al posto dell’E-tag sia rigoroso e robusto ed elimini la necessità di un’incubazione secondaria di anticorpi, presenta alcune limitazioni. Una limitazione è che abbiamo usato D11 coniugato con fosfatasi alcalina nell’estratto periplasmatico e potrebbe esserci una falsa colorazione della fosfatasi alcalina endogena nell’estratto periplasmatico o in alcuni tessuti, come l’intestino24. Tuttavia, il primo passo per sviluppare questo protocollo includeva la disabilitazione della fosfatasi alcalina endogena che può essere presente nei tessuti25. Inizialmente, l’acido acetico freddo, BME e levamisolo26 sono stati testati per l’efficienza. Nessuno di questi ha completamente diminuito la presenza di fosfatasi alcalina endogena attiva. Il calore è stato utilizzato per disattivare la fosfatasi alcalina27, quindi abbiamo testato la disattivazione termica della fosfatasi alcalina in diversi tamponi. Abbiamo scoperto che i vetrini riscaldanti e idratati nel tampone citrato hanno eliminato la maggior parte della fosfatasi alcalina endogena. I vetrini sono stati sviluppati inizialmente utilizzando un substrato chemiluminescente / fluorescente, ma quando le immagini sono state visualizzate senza questo substrato, c’era un’elevata quantità di autofluorescenza. VectorRed è un substrato che si sviluppa in presenza di fosfatasi alcalina per produrre un cromogeno che può essere visualizzato nella gamma di canali Texas Red / TRITC. Utilizzando questo substrato, siamo stati in grado di osservare più facilmente il segnale sopra l’autofluorescenza di fondo. È necessario prestare attenzione durante il processo di colorazione per ridurre al minimo la colorazione artificiosa. L’essiccazione dei tessuti sui vetrini dopo l’idratazione fino a quando l’imaging non ha portato a un maggiore sviluppo. D11-AP deve essere aliquotato e conservato a -20 °C. Cicli multipli di gelo-disgelo dovrebbero essere evitati quando si lavora con D11-AP. Anche la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) può influenzare l’attività enzimatica della fosfatasi alcalina e non deve essere utilizzata come tampone di lavaggio28. Come con qualsiasi approccio basato sugli anticorpi, è necessario eseguire test approfonditi e ottimizzazione per garantire che la colorazione sia specifica e che il segnale non sia sovraamplificato o sottoamplificato.
In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato potente, rigoroso e robusto per rilevare le proteine addotto IsoLG utilizzando l’anticorpo D11 coniugato con fosfatasi alcalina al posto dell’E-tag. Questo protocollo presenta diversi vantaggi: in primo luogo, l’utilizzo di D11 come proteina di fusione della fosfatasi alcalina è più economico. D11 è stato originariamente derivato da una libreria di anticorpi fagici che non poteva essere commercializzata ed era costoso da purificare. Sebbene D11 nell’estratto periplasmatico di E. coli potesse fornire un’alternativa poco costosa, era inefficace nella maggior parte dei test. In secondo luogo, l’approccio di fusione della fosfatasi alcalina consente a D11 scfv di avere un utile reporter15 (fosfatasi alcalina) fuso ad esso e non avrebbe bisogno di essere purificato per l’uso in saggi immunologici poiché i substrati sono disponibili in commercio. In terzo luogo, la fosfatasi alcalina di E. coli forma dimeri29. Quindi D11, quando fuso alla fosfatasi alcalina, formerebbe anche dimeri e questo aumenta l’avidità dell’anticorpo e l’attività di legame30. Infine, D11 coniugato con fosfatasi alcalina in estratto periplasmatico può essere facilmente pulito utilizzando Cibacron Blue Sepharose. D11 ha un alto punto isoelettrico (~9,2 pH). Come tale, è caricato positivamente e può legarsi a Cibacron Blue attraverso interazioni pi-cationiche. La maggior parte delle impurità nell’estratto periplasmatico di E. coli possono essere eluite dalla resina. Il D11 coniugato con fosfatasi alcalina può quindi essere eluito usando sale alto (~ 1,5 M NaCl) in acqua. Il D11 eluito coniugato con fosfatasi alcalina è abbastanza stabile a 4-8 °C nella soluzione ad alto contenuto di sale. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo che non solo rende disponibile l’anticorpo D11 a basso costo, ma elimina anche i passaggi aggiuntivi e la necessità di incubazione secondaria degli anticorpi. Questo protocollo facilita la misurazione riproducibile degli IsoLG, che si accumulano nei tessuti in molteplici malattie in cui l’aumento dello stress ossidativo gioca un ruolo.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 e R03HL155041 ad A.K. Ringraziamo la Digital Histology Shared Resource – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 per la visualizzazione e la scansione delle diapositive.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |