Este artículo proporciona una metodología detallada para la medición de isolevuglandinas en tejidos por inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo ScFv D11 conjugado con fosfatasa alcalina. Los modelos de hipertensión tanto en ratones como en humanos se utilizan para explicar los procedimientos paso a paso y los principios fundamentales asociados con la medición de isolevuglandina en muestras de tejido.
Las isolevuglandinas (IsoLG) son cetoaldehídos gamma altamente reactivos formados a partir de isoprostanos H2 a través de la peroxidación lipídica y las proteínas de reticulación que conducen a la inflamación y diversas enfermedades, incluida la hipertensión. La detección de la acumulación de IsoLG en los tejidos es crucial para arrojar luz sobre su participación en los procesos de la enfermedad. Sin embargo, la medición de IsoLG en tejidos es extremadamente difícil, y las herramientas disponibles actualmente, incluido el análisis de espectrometría de masas, son laboriosas y extremadamente costosas. Aquí describimos un nuevo método para la detección in situ de IsoLGs en tejidos utilizando ScFv D11 conjugado con fosfatasa alcalina y un anticuerpo recombinante de visualización de fagos producido en E. coli por microscopía inmunofluorescente. Se utilizaron cuatro controles para validar la tinción: (1) tinción con y sin D11, (2) tinción con extracto periplásmico bacteriano con el ligador de fosfatasa alcalina, (3) tinción de anticuerpos scFV irrelevante y (4) control competitivo con IsoLG antes de la tinción. Demostramos la eficacia de la fosfatasa alcalina conjugada D11 en tejidos humanos y de ratón con o sin hipertensión. Este método probablemente servirá como una herramienta importante para estudiar el papel de los IsoLG en una amplia variedad de procesos de enfermedad.
Las isolevugglandinas (IsoLGs), también conocidas como isocetales, son isómeros de la familia 4-cetoaldehído, que son productos de la peroxidación lipídica, y reaccionan y se adducen a aminas primarias en proteínas 1,2. Los IsoLGs han sido implicados en varias enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares, de Alzheimer, pulmonares y hepáticas, y muchos tipos de cáncer3. Los IsoLG se han estudiado más ampliamente en su contribución a la enfermedad cardiovascular (ECV), que es una carga económica y de salud significativa a nivel mundial, incluidos los Estados Unidos. Se estima que 92,1 millones de adultos estadounidenses tienen al menos un tipo de ECV, con proyecciones estimadas para 2030 que alcanzan el 43,9% de la población adulta de los Estados Unidos4. La disminución de la presión arterial, el colesterol y el abandono del hábito de fumar reduce el riesgo general y la aparición de eventos de ECV5.
La hipertensión arterial o hipertensión es un factor de riesgo importante para la enfermedad cardiovascular y afecta aproximadamente a la mitad de la población estadounidense6. Estudios previos han encontrado que la inflamación es una causa subyacente de hipertensión y que los IsoLGs juegan un papel7. Los estímulos hipertensivos, incluyendo angiotensina II, catecolaminas, aldosterona y exceso de sal dietética, inducen la acumulación de IsoLG en las células presentadoras de antígenos, incluidas las células dendríticas (DC), que a su vez activan las células T para proliferar y producir citoquinas inflamatorias que contribuyen a la hipertensión 8,9.
Anteriormente, los IsoLGs se han medido mediante inmunohistoquímica, espectrometría de masas, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas y citometría de flujo10,11. Para facilitar la medición de IsoLGs, se desarrolló un anticuerpo recombinante (D11) de variable de fragmento de cadena única (scfv) contra IsoLGs12. Inicialmente, este anticuerpo D11 contenía una etiqueta E de 11 aminoácidos y requería un anticuerpo secundario para la detección inmunohistoquímica11. Sin embargo, fue difícil encontrar un anticuerpo secundario confiable contra la etiqueta E después de la interrupción de su producción por parte del fabricante. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo confiable para la tinción inmunofluorescente de IsoLGs utilizando D11 conjugado con fosfatasa alcalina (D11-AP), que hemos demostrado en tejidos de ratón y humanos con y sin hipertensión.
D11 se ha utilizado ampliamente para detectar proteínas aducidas por IsoLG en células o tejidos como marcador de inflamación o estrés oxidativo en la enfermedad 8,9,20. Anteriormente, D11 contenía una etiqueta E y el desarrollo de IHQ requería el uso de un anticuerpo secundario anti-E conjugado con HRP10,20,21. Aquí, hemos desarrollado y optimizado el protocolo para la detección de proteínas aducidas por IsoLG utilizando el anticuerpo D11 conjugado con fosfatasa alcalina en lugar de la etiqueta E, lo que elimina la necesidad de una incubación secundaria de anticuerpos.
Para determinar la especificidad de D11-AP, se realizaron cuatro experimentos de control negativo. Realizamos el protocolo sin la presencia de D11 y tuvimos un desarrollo mínimo. Estos resultados tienen una doble indicación: la fosfatasa alcalina endógena no contribuye al desarrollo, y la tinción observada se debe a D11 y no a otro factor contribuyente. A continuación, teñimos las diapositivas con el enlazador AP sin D11. Este experimento resultó en poca tinción, lo que indica que AP libre u otros factores en el extracto periplásmico no están causando la tinción que observamos en presencia de D11. Para garantizar la especificidad de D11 a IsoLG, preincubamos D11-AP con IsoLG purificado antes de teñir los portaobjetos. Vimos una disminución en el desarrollo que indica que el D11-AP se unió a la proteína IsoLG, agotando así la cantidad de D11-AP libre para unirse a IsoLG presente en el tejido. Finalmente, para asegurarnos de que D11-AP se unía a IsoLG y no a la proteína MSA a la que se unía IsoLG, preincubamos D11-AP solo con MSA. No hubo cambios en el desarrollo, lo que indica que D11-AP no se unía a MSA sino a la proteína IsoLG. Por último, los investigadores que desarrollaron el protocolo de tinción estaban ciegos al estado hipertensivo del tejido intestinal humano. Las diferencias en la tinción observadas entre pacientes con hipertensión y pacientes con normotensión no fueron debidas a sesgo y han sido descritas previamente22,23.
Aunque nuestro protocolo para la detección de proteínas aducidas por IsoLG utilizando el anticuerpo D11 conjugado con fosfatasa alcalina en lugar de la etiqueta E es riguroso y robusto y elimina la necesidad de una incubación secundaria de anticuerpos, tiene algunas limitaciones. Una limitación es que utilizamos D11 conjugado con fosfatasa alcalina en el extracto periplásmico, y podría haber tinción falsa de fosfatasa alcalina endógena en el extracto periplásmico o ciertos tejidos, como el intestino24. Sin embargo, el primer paso para desarrollar este protocolo incluyó la desactivación de la fosfatasa alcalina endógena que puede estar presente en los tejidos25. Inicialmente, se probó la eficiencia del ácido acético frío, el BME y el levamisol26 . Ninguno de estos disminuyó completamente la presencia de fosfatasa alcalina endógena activa. El calor se ha utilizado para desactivar la fosfatasa alcalina27, por lo que probamos la desactivación térmica de la fosfatasa alcalina en diferentes tampones. Encontramos que los portaobjetos hidratados y montados en el calentamiento en el tampón citrato eliminaron la mayoría de la fosfatasa alcalina endógena. Las diapositivas se desarrollaron inicialmente utilizando un sustrato quimioluminiscente / fluorescente, pero cuando se obtuvieron imágenes sin este sustrato, hubo una gran cantidad de autofluorescencia. VectorRed es un sustrato que se desarrolla en presencia de fosfatasa alcalina para producir un cromógeno que se puede visualizar en el rango de canales Texas Red/TRITC. Usando este sustrato, pudimos observar más fácilmente la señal sobre la autofluorescencia de fondo. Se debe tener cuidado durante el proceso de tinción para minimizar la tinción artificial. Secado de los tejidos en portaobjetos después de la hidratación hasta que las imágenes hayan resultado en un mayor desarrollo. D11-AP debe ser alícuota y almacenado a -20 °C. Se deben evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación cuando se trabaja con D11-AP. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) también puede afectar la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina y no debe utilizarse como tampón de lavado28. Al igual que con cualquier enfoque basado en anticuerpos, se deben llevar a cabo pruebas exhaustivas y optimización para garantizar que la tinción sea específica y que la señal no se amplifique en exceso o en exceso.
En conclusión, hemos desarrollado un protocolo optimizado potente, riguroso y robusto para detectar proteínas aducidas por IsoLG utilizando el anticuerpo D11 conjugado con fosfatasa alcalina en lugar de la etiqueta E. Este protocolo presenta varias ventajas: En primer lugar, el uso de D11 como proteína de fusión de fosfatasa alcalina es más barato. D11 se derivó originalmente de una biblioteca de anticuerpos de fagos que no se podía comercializar y era costosa de purificar. Aunque D11 en el extracto periplásmico de E. coli podría proporcionar una alternativa económica, fue ineficaz en la mayoría de los ensayos. En segundo lugar, el enfoque de fusión de fosfatasa alcalina permite que D11 scfv tenga un informador útil15 (fosfatasa alcalina) fusionado y no necesitaría ser purificado para su uso en inmunoensayos, ya que los sustratos están disponibles comercialmente. En tercer lugar, la fosfatasa alcalina E. coli forma dímeros29. Por lo tanto, D11, cuando se fusiona con la fosfatasa alcalina, también formaría dímeros y esto aumentaría la avidez del anticuerpo y la actividad de unión30. Finalmente, D11 conjugado con fosfatasa alcalina en extracto periplásmico se puede limpiar fácilmente usando Cibacron Blue Sepharose. D11 tiene un punto isoeléctrico alto (~9.2 pH). Como tal, está cargado positivamente y puede unirse a Cibacron Blue a través de interacciones de pi-cation. La mayoría de las impurezas en el extracto periplásmico de E. coli se pueden eluir de la resina. El D11 conjugado con fosfatasa alcalina puede ser eluydo usando sal alta (~1.5M NaCl) en agua. El D11 eluyido conjugado con fosfatasa alcalina es bastante estable a 4-8 °C en la solución de alta sal. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo que no solo hace que el anticuerpo D11 esté disponible a bajo costo, sino que también elimina los pasos adicionales y la necesidad de la incubación secundaria de anticuerpos. Este protocolo facilita la medición reproducible de IsoLGs, que se acumulan en tejidos en múltiples enfermedades donde el aumento del estrés oxidativo juega un papel.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 y R03HL155041 a A.K. Agradecemos al recurso compartido de histología digital – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 por la visualización y el escaneo de diapositivas.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |