本文提供了使用碱性磷酸酶偶联的 ScFv D11 抗体通过免疫荧光测量组织中异左旋前列腺素的详细方法。小鼠和人类的高血压模型用于解释与组织样本中异左旋蛋白测量相关的分步程序和基本原理。
异左旋前列腺素(IsoLGs)是由H2-异前列烷通过脂质过氧化和交联蛋白形成的高反应性γ酮醛,导致炎症和包括高血压在内的各种疾病。检测组织中的IsoLG积累对于揭示它们参与疾病过程至关重要。然而,组织中IsoLGs的测量非常困难,目前可用的工具,包括质谱分析,既费力又极其昂贵。在这里,我们描述了一种使用碱性磷酸酶偶联的D11 ScFv和通过免疫荧光显微镜在大肠杆菌中产生的重组噬菌体展示抗体原位检测组织中IsoLGs的新方法。四种对照用于验证染色:(1)使用和不使用D11染色,(2)用碱性磷酸酶接头用细菌周质提取物染色,(3)无关的scFV抗体染色,以及(4)染色前与IsoLG竞争性对照。我们证明了碱性磷酸酶偶联D11在有或没有高血压的人和小鼠组织中的有效性。这种方法可能会成为研究IsoLGs在各种疾病过程中的作用的重要工具。
异左旋前列腺素(IsoLGs),也称为异酮醇,是4-酮醛家族的异构体,是脂质过氧化的产物,与蛋白质1,2上的伯胺反应并加合。IsoLGs与多种疾病有关,包括心血管,阿尔茨海默氏症,肺部和肝脏疾病以及许多类型的癌症3。IsoLGs在对心血管疾病(CVD)的贡献方面得到了最广泛的研究,心血管疾病是包括美国在内的全球重大健康和经济负担。据估计,9210 万美国成年人至少患有一种类型的心血管疾病,预计 2030 年将达到美国成年人口的 43.9%4。降低血压、胆固醇和戒烟可降低心血管疾病事件的总体风险和发生率5.
高血压是心血管疾病的主要危险因素,影响大约一半的美国人口6。以前的研究发现,炎症是高血压的根本原因,IsoLGs发挥作用7。高血压刺激,包括血管紧张素 II、儿茶酚胺、醛固酮和过量膳食盐,诱导 IsoLG 在包括树突状细胞 (DC) 在内的抗原呈递细胞中积累,进而激活 T 细胞增殖并产生导致高血压的炎性细胞因子8,9。
以前,IsoLGs 已通过免疫组织化学、质谱、酶联免疫吸附测定和流式细胞术10,11 进行测量。为了便于测量IsoLGs,开发了一种针对IsoLGs12的单链片段变量(scfv)重组抗体(D11)。最初,该 D11 抗体含有 11 个氨基酸 E-tag,需要二抗进行免疫组织化学检测11。然而,在制造商停止生产E-tag后,很难找到可靠的针对E-tag的二抗。因此,我们开发了一种可靠的方案,用于使用与碱性磷酸酶(D11-AP)偶联的D11对IsoLGs进行免疫荧光染色,我们已经在有和没有高血压的小鼠和人体组织中证明了这一点。
D11已被广泛用于检测细胞或组织中的IsoLG加合蛋白,作为疾病8,9,20中炎症或氧化应激的标志物。以前,D11包含一个E标签,IHC开发需要使用与HRP10,20,21偶联的二级抗E标签抗体。在这里,我们开发并优化了使用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体代替E标签检测IsoLG加合蛋白的方案,这消除了二抗孵育的需要。
为了确定D11-AP的特异性,进行了四个阴性对照实验。我们在没有D11的情况下执行了协议,并且几乎没有开发。这些结果具有双重指示:内源性碱性磷酸酶对发育没有贡献,观察到的染色是由于D11而不是另一个促成因素。接下来,我们用不含D11的AP接头对载玻片进行染色。该实验导致很少的染色,这表明周质提取物中的游离AP或其他因素不会导致我们在存在D11的情况下观察到的染色。为了确保D11对IsoLG的特异性,我们在载玻片染色前将D11-AP与纯化的IsoLG预孵育。我们看到发育的减少,这表明D11-AP与IsoLG蛋白结合,从而耗尽了游离D11-AP与组织中存在的IsoLG结合的量。最后,为了确保D11-AP与IsoLG结合,而不是IsoLG结合的MSA蛋白,我们仅用MSA预孵育D11-AP。发育没有变化,表明D11-AP不与MSA结合,而是与IsoLG蛋白结合。最后,开发染色方案的研究人员对人类肠道组织的高血压状态视而不见。高血压患者和血压正常患者之间观察到的染色差异不是由于偏倚,之前已经描述过22,23。
尽管我们使用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体代替E-tag检测IsoLG加合蛋白的方案严格而稳健,并且无需二抗孵育,但它存在一些局限性。一个限制是,我们在周质提取物中使用了与碱性磷酸酶偶联的D11,并且在周质提取物或某些组织(例如肠24)中可能存在内源性碱性磷酸酶的假染色。然而,开发该协议的第一步包括禁用可能存在于组织中的内源性碱性磷酸酶25。最初,对冷乙酸,BME和左旋咪唑26 进行效率测试。这些都没有完全减少活性内源性碱性磷酸酶的存在。热量已被用于使碱性磷酸酶27失活,因此我们测试了碱性磷酸酶在不同缓冲液中的热失活。我们发现柠檬酸盐缓冲液中的加热安装和水合载玻片消除了大多数内源性碱性磷酸酶。载玻片最初使用化学发光/荧光底物开发,但是当没有这种底物成像时,存在大量的自发荧光。VectorRed是一种底物,在碱性磷酸酶存在下形成,产生可以在德克萨斯红/ TRITC通道范围内可视化的显色原。使用这种底物,我们能够更容易地观察背景自发荧光以上的信号。在染色过程中应小心,以尽量减少人为染色。水合后在载玻片上干燥组织,直到成像导致发育加速。D11-AP应等分并储存在-20°C。 使用 D11-AP 时,应避免多次冻融循环。磷酸盐缓冲盐水(PBS)也可影响碱性磷酸酶的酶活性,不应用作洗涤缓冲液28。与任何基于抗体的方法一样,必须进行彻底的测试和优化,以确保染色具有特异性,并且信号不会过度放大或放大不足。
总之,我们开发了一种强大、严格且稳健的优化方案,使用与碱性磷酸酶偶联的 D11 抗体代替 E-tag 来检测 IsoLG 加合蛋白。该方案具有几个优点:首先,使用D11作为碱性磷酸酶融合蛋白更便宜。D11最初来源于噬菌体抗体库,该库无法商业化且纯化成本高昂。尽管 大肠杆菌 周质提取物中的D11可以提供廉价的替代品,但在大多数测定中无效。其次,碱性磷酸酶融合方法允许D11 scfv具有有用的报告基因15 (碱性磷酸酶)融合,并且不需要纯化用于免疫测定,因为底物是市售的。第三, 大肠杆菌 碱性磷酸酶形成二聚体29。所以D11与碱性磷酸酶融合时也会形成二聚体,这增加了抗体的亲和力和结合活性30。最后,D11与周质提取物中的碱性磷酸酶偶联,可以使用Cibacron Blue Sepharose轻松清洁。D11具有高等电点(~9.2 pH)。因此,它带正电,可以通过pi阳离子相互作用与Cibacron Blue结合。 大肠杆菌 周质提取物中的大部分杂质都可以从树脂中洗脱出来。然后可以使用高盐(~1.5M NaCl)在水中洗脱与碱性磷酸酶偶联的D11。与碱性磷酸酶偶联的洗脱D11在高盐溶液中在4-8°C下相当稳定。因此,我们开发了一种方案,不仅可以以低成本提供D11抗体,还可以消除二抗孵育的额外步骤和需求。该协议有助于IsoLGs的可重复测量,IsoLGs在氧化应激增加的多种疾病中积累在组织中。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款K01HL130497,R01HL147818,R01HL144941和R03HL155041的支持。我们感谢数字组织学共享资源 – 范德比尔特健康中心田纳西州纳什维尔 https://www.vumc.org/dhsr/46298 可视化和玻片扫描。
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |