Vakum Yardımlı Sorbent Ekstraksiyonu ile İnsanla İlişkili Numunelerden Aktif Olarak Üretilen Mikrobiyal Uçucu Organik Bileşiklerin Yakalanması
Summary
Bu protokol, biyolojik bir numuneden uçucu organik bileşiklerin vakum destekli sorbent ekstraksiyon yöntemi, Entech Numune Hazırlama Rayı kullanılarak kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ve veri analizi ile ekstraksiyonunu açıklar. Ayrıca biyolojik örneklerin kültürünü ve kararlı izotop sondalamasını da açıklar.
Abstract
Biyolojik örneklerden elde edilen uçucu organik bileşiklerin (VOC’ler) bilinmeyen kökenleri vardır. VOC’ler, konakçıdan veya konağın mikrobiyal topluluğundan farklı organizmalardan kaynaklanabilir. Mikrobiyal VOC’lerin kökenini çözmek için, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii’nin bakteriyel mono- ve ko-kültürlerinin uçucu kafa boşluğu analizi ve dışkı, tükürük, kanalizasyon ve balgamın biyolojik örneklerinde kararlı izotop sondalaması yapıldı. Mono- ve ko-kültürler, bireysel bakteri türlerinden uçucu üretimi tanımlamak için veya biyolojik örneklerden mikropların aktif metabolizmasını tanımlamak için kararlı izotop sondalaması ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.
VOC’leri çıkarmak için vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE) kullanıldı. VASE, yarı uçucu ve uçucu bileşikler için kullanımı kolay, ticarileştirilmiş, solventsiz bir kafa boşluğu ekstraksiyon yöntemidir. Solventlerin eksikliği ve ekstraksiyon sırasında kullanılan vakuma yakın koşullar, tert-bütilasyon ve katı faz mikroekstraksiyonu gibi diğer ekstraksiyon seçenekleriyle karşılaştırıldığında nispeten kolay ve hızlı bir yöntem geliştirmeyi sağlar. Burada açıklanan iş akışı, mono ve ortak kültürlerden belirli geçici imzaları tanımlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, insanla ilişkili biyolojik örneklerin kararlı izotop sondalamasının analizi, yaygın veya benzersiz bir şekilde üretilen VOC’leri tanımladı. Bu yazıda VASE’nin genel iş akışı ve deneysel hususları, canlı mikrobiyal kültürlerin stabil izotop problanması ile birlikte sunulmaktadır.
Introduction
Uçucu organik bileşikler (VOC’ler) bakteriyel tespit ve tanımlama için büyük umut vaat etmektedir, çünkü tüm organizmalardan yayılırlar ve farklı mikroplar benzersiz VOC imzalarına sahiptir. Uçucu moleküller, kronik obstrüktif akciğer hastalığı1, idrarda tüberküloz2 3 ve ventilatör ilişkili pnömoni4 dahil olmak üzere çeşitli solunum yolu enfeksiyonlarını tespit etmek için invaziv olmayan bir ölçüm olarak kullanılmış, ayrıca kistik fibrozlu (KF) denekleri sağlıklı kontrol deneklerinden ayırt etmek 5,6. Uçucu imzalar, KF’deki spesifik patojen enfeksiyonları ayırt etmek için bile kullanılmıştır (Staphylococcus aureus 7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 ve S. aureus vs. P. aeruginosa10). Bununla birlikte, bu tür biyolojik örneklerin karmaşıklığı ile, belirli VOC’lerin kaynağını belirlemek genellikle zordur.
Uçucu profilleri çoklu enfekte edici mikroplardan ayırmak için bir strateji, hem mono- hem de ko-kültürdeki mikroorganizmaların kafa boşluğu analizini yapmaktır11. Kafa boşluğu analizi, numunenin kendisine gömülü olanlardan ziyade bir numunenin üzerindeki “kafa boşluğuna” yayılan analitleri inceler. Mikrobiyal metabolitler, karmaşık klinik örneklerde mikrobiyal metabolitlerin kökenini belirlemedeki zorluk nedeniyle mono-kültürlerde sıklıkla karakterize edilmiştir. Bakteriyel mono-kültürlerden uçucuların profilini çıkararak, bir mikrobun in vitro olarak ürettiği uçucu tipler, uçucu repertuarının bir taban çizgisini temsil edebilir. Bakteri kültürlerini birleştirmek, örneğin ortak kültürler oluşturmak ve üretilen uçucu moleküllerin profilini çıkarmak, bakteriler arasındaki etkileşimleri veya çapraz beslenmeyi ortaya çıkarabilir12.
Uçucu moleküllerin mikrobiyal kökenini tanımlamak için bir başka strateji, kararlı bir izotop ile etiketlenmiş bir besin kaynağı sağlamaktır. Kararlı izotoplar doğal olarak oluşur, farklı sayıda nötrona sahip radyoaktif olmayan atom formlarıdır. 1930’ların başından beri hayvanlarda aktif metabolizmayı izlemek için kullanılan bir stratejide13, mikroorganizma etiketli besin kaynağından beslenir ve kararlı izotopu metabolik yolaklarına dahil eder. Daha yakın zamanlarda, klinik bir CF balgam örneği14’te metabolik olarak aktif S. aureus’u tanımlamak için ağır su (D2O) şeklinde kararlı bir izotop kullanılmıştır. Başka bir örnekte, P. aeruginosa ve Rothia mucilaginosa12’nin CF klinik izolatları arasındaki metabolitlerin çapraz beslenmesini göstermek için 13C etiketli glikoz kullanılmıştır.
Kütle spektrometresi tekniklerinin ilerlemesiyle, uçucu ipuçlarını tespit etme yöntemleri nitel gözlemlerden daha nicel ölçümlere geçmiştir. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GC-MS) kullanılarak, biyolojik numunelerin işlenmesi çoğu laboratuvar veya klinik ortam için ulaşılabilir hale gelmiştir. Uçucu molekülleri araştırmak için birçok yöntem, gıda, bakteri kültürleri ve diğer biyolojik numuneler ve kontaminasyonu tespit etmek için hava ve su gibi numunelerin profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, yüksek verimli uçucu numune alımının birkaç yaygın yöntemi çözücü gerektirir ve vakumlu ekstraksiyonun sağladığı avantajlarla gerçekleştirilmez. Ek olarak, 15,16,17,18,19 analizi için genellikle daha büyük hacimler veya miktarlar (0,5 mL’den büyük) numune alınan malzemeler gereklidir, ancak bu substrata özgüdür ve her numune tipi ve yöntemi için optimizasyon gerektirir.
Burada, vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE), ardından bir GC-MS üzerinde termal desorpsiyon, bakteriyel mono- ve ko-kültürlerin uçucu profillerini araştırmak ve insan dışkısı, tükürük, kanalizasyon ve balgam örneklerinden stabil izotop sondalaması ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için kullanılmıştır (Şekil 1). Sınırlı numune miktarlarıyla, VOC’ler 15 μL balgamdan ekstrakte edildi. İnsan örnekleriyle yapılan izotop sondalama deneyleri, mikrobiyal topluluğun büyümesini geliştirmek için 13C glikoz ve ortam gibi kararlı bir izotop kaynağı eklemeyi gerektiriyordu. Uçucuların aktif üretimi, GC-MS tarafından daha ağır bir molekül olarak tanımlanmıştır. Uçucu moleküllerin statik vakum altında ekstraksiyonu, artan hassasiyete sahip uçucu moleküllerin tespit edilmesini sağladı20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro kültürlerde ve insanla ilişkili örneklerde uçucu üretimi tanımlamak için, P. aeruginosa, S. aureus ve A. baumanii’nin mono ve ko-kültürlerinin uçucu analizi ve farklı biyolojik örneklerin kararlı izotop sondalaması yapılmıştır. Mono- ve ko-kültürlerin analizinde, 70 °C’de 1 saat kısa bir ekstraksiyon yapılarak uçucular tespit edildi. Mono ve ortak kültürlerin uçucu analizi, hem bireysel türler tarafından hem de diğer türlerle etkileşimleri sırasında …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazıyı dikkatli bir şekilde düzenledikleri için Heather Maughan ve Linda M. Kalikin’e teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NHLBI (hibe 5R01HL136647-04) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
Riferimenti
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can ‘rule-in’ Pseudomonas aeruginosa and ‘rule-out’ Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
