在这里,我们介绍了如何生成非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关的肝细胞癌(HCC)斑马鱼模型,以研究胆固醇过剩对肝脏微环境和免疫细胞景观的影响。
肝癌目前是全球癌症相关死亡的第三大原因,肝细胞癌(HCC)占所有肝癌病例的75-90%。随着预防和治疗乙型肝炎的有效治疗方法的引入,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)以及被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的更具侵略性的形式正迅速成为现代社会中发生HCC的头号危险因素。为了更好地了解NASH在HCC发展中的作用,我们设计了一种NASH相关的HCC斑马鱼。斑马鱼幼虫的光学清晰度和遗传可追踪性使其成为使用非侵入性荧光活成像研究肝脏微环境和免疫细胞组成的有吸引力且强大的模型。该协议描述了如何使用NASH相关的HCC斑马鱼模型来研究肝脏微环境中胆固醇过剩的影响及其对疾病早期免疫细胞组成的影响。首先,我们用10%的高胆固醇饮食喂养表达肝细胞特异性活化β-连环蛋白的HCC幼虫(s704Tg)8天,以开发NASH相关的HCC模型。在这里,我们描述了如何利用不同的转基因系通过非侵入性共聚焦显微镜评估肝脏中的几种早期恶性肿瘤特征,例如肝脏区域,细胞和核形态(肝细胞区域,核区域,核:细胞质比(N:C比率),核循环性,微核/核突出评分)和血管生成。然后,使用带有标记免疫细胞(中性粒细胞,巨噬细胞和T细胞)的转基因系,我们展示了如何分析NASH相关HCC幼虫中的肝脏免疫细胞组成。所描述的技术可用于评估早期肝癌发生阶段的肝脏微环境和免疫细胞组成,但也可以对其进行修改以研究其他肝病模型中的这些特征。
肝细胞癌(HCC)是一种侵袭性癌症,治疗选择有限。已经发现,超过30%的HCC患者肥胖并患有NASH,NASH是NAFLD的一种侵袭性形式1,2,3,4。摄入富含卡路里的饮食会大大增加脂肪酸的可用性,从而导致局部和全身代谢变化并引发脂肪变性、肝细胞损伤、炎症和纤维化——这些都是 NASH 的关键特征。NASH进展为HCC涉及肝脏中脂质的积累,从而引发炎症并改变免疫细胞组成5,6,7。了解肝脏微环境和免疫细胞景观在肝病进展过程中如何改变,以及它如何由于某些病因因素而变化,具有特别的兴趣和重要性。为了更好地确定胆固醇过剩对肝脏微环境和免疫细胞景观的影响,我们开发了一种独特的NASH相关HCC斑马鱼模型。该模型的使用使我们更好地了解饮食和营养过剩对肝脏微环境和肝病进展的影响。
哺乳动物模型,如小鼠和人体组织样本,对于理解脂肪性肝炎和脂肪变性的发病机制至关重要8。小鼠是肝病和癌症的首选模型,但它们在细胞水平上缺乏光学清晰度,而人体组织样本通常缺乏动物模型能够模仿的3D环境。这些障碍使斑马鱼成为研究界的强大模型。斑马鱼与人类有着显着的相似之处,至少有70%的基因保护。它们维持肝脏微环境、肝细胞组成、功能、信号传导和对损伤的反应9,10。使用高胆固醇饮食(HCD)结合已建立的HCC转基因斑马鱼模型,我们开发了NASH相关HCC的斑马鱼模型。
在这里,我们提出了一个协议,解释了如何生成与NASH相关的HCC斑马鱼模型,以及如何研究肝脏微环境并解决体内早期恶性肿瘤特征。使用非侵入性共聚焦显微镜与具有荧光标记肝细胞膜和细胞核的斑马鱼转基因系相结合,我们可以通过分析肝脏形态(面积、体积和表面积)、细胞和核形态(肝细胞面积、核面积、N:C 比、核循环度、微核/核疝评分)和血管生成(血管密度)来解决早期恶性肿瘤特征。免疫细胞微环境也是肝癌发生的重要特征11,12,13,14,因此,我们还展示了如何使用具有标记免疫细胞(中性粒细胞,巨噬细胞和T细胞)的转基因斑马鱼系分析NASH相关HCC幼虫中的肝脏免疫细胞组成。所描述的技术是该模型独有的,对于评估肝病进展中的肝脏微环境和免疫细胞组成非常有用。
随着HCC发病率的增加,特别是NASH诱导的HCC,拥有更有效的模型来研究NASH相关HCC所涉及的细胞和分子机制非常重要。肝脏细胞-细胞相互作用的反卷积对于更好地了解肝病进展和肝癌发生至关重要。本协议中描述的方法提供了一种独特的方法来分析 体内 和非侵入性肝病进展。
饮食的准备对于成功建立NASH相关的HCC模型至关重要。重要的是让乙醚在通风橱内完全蒸发以避免有害影响,同时为斑马鱼准备饮食。为了将这些饮食与幼虫一起使用(受精后5-12天),将饮食磨成细颗粒以确保幼虫摄入食物非常重要。使用荧光标记的脂肪酸类似物可用于评估幼虫的食物摄入量。
在将幼虫放入繁殖箱并开始喂食程序之前,通过混合来自不同平板的幼虫来确保实验取样均匀至关重要。这一步很重要,因为从第0天开始,每个平板中都会促进不同的微环境,并可能影响炎症反应。
另一个重要步骤是计算幼虫数量,以了解每个喂食箱需要多少食物。如果食物量不足以满足每个箱子中存在的幼虫数量,将发生以下两种情况之一:1)幼虫将喂养不足;2)幼虫会过度喂食。不准确的喂养会导致与营养不良或营养过剩相关的不健康状况,例如炎症,这将极大地影响肝脏微环境。如果发生不准确的喂养,幼虫会出现运动问题。在这个发育阶段,幼虫应该密集游泳,因此,如果注意到运动问题,幼虫是在不健康的条件下饲养的(营养不良或由于过度喂养而暴露于有毒剂量的胆固醇)。出于这个原因,需要严格控制正常饮食和富含胆固醇的饮食的喂养程序。可以进行一些测定以快速解决幼虫喂养和健康的准确性,包括肝肿大(肝脏大小)和组织和器官炎症,特别是肝脏和肠道(中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显增加)。
每天清洁和更换95%的E3对于减少饲养箱中微生物的生长以及改善幼虫的健康和存活至关重要。或者,可以将幼虫放置在独立的机架系统中。为获得最佳效果,将 60-80 只幼虫放入 3 升水箱中。通过将流量调整为快速滴水模式并每天两次(上午和下午)喂食幼虫3-4毫克,将水流量保持在最低水平。应定期检查水流量,以确保每个水箱中的水流正确。在我们的实验室中,这种方法为我们提供了95-100%的存活率,短期喂养10%的HCD。此外,该方法大大减少了静态进料方案中描述的日常清洁和水交换所必需的固有工作量。
虽然我们利用富含10%胆固醇的饮食在短期暴露中诱导NASH(5天足以诱发脂肪性肝炎),但可以进行饮食改变并扩大到使用果糖 18,脂肪酸(如棕榈酸)19,或可以使用4%富含胆固醇的饮食扩展的喂养方案20。目前,HCC的成功治疗靶点很少,NASH也没有。斑马鱼模型的使用提供了一个独特的机会来扩展我们对肝癌发生的知识,同时也提供了一个无与伦比的脊椎动物系统来执行大通量药物筛选。本协议中描述的技术将有助于肝脏疾病和肝癌发生的未来发现和治疗靶点。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院斑马鱼核心设施技术人员克林顿·德保罗和斯巴达克·加里宁为我们的斑马鱼系提供帮助和维护。FJMN得到了癌症研究所和纤维层状癌症基金会的支持。
Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | – | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
Microscopes | |||
Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
Software | |||
Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |