Summary

Скрининг пептидов, которые активируют MRGPRX2 с использованием инженерных HEK-клеток

Published: November 06, 2021
doi:

Summary

Описаны методы генерации библиотеки коротких пептидов, которые могут активировать тучные клетки через рецептор MRGPRX2. Связанные методы просты, недороги и могут быть распространены на другие клеточные рецепторы.

Abstract

Идентификация лигандов, специфичных для терапевтически значимых клеточных рецепторов, имеет решающее значение для многих применений, включая проектирование и разработку новых терапевтических средств. Связанный с Mas рецептор G-белка-X2 (MRGPRX2) является важным рецептором, который регулирует активацию тучных клеток и, таким образом, направляет общий иммунный ответ. Многочисленные лиганды для MRGPRX2 были идентифицированы и включают эндогенные пептиды, такие как PAMP, defensins, LL-37 и другие фрагменты белка (т.е. деградированный альбумин). Дальнейшая идентификация специфических лигандов MRGPRX2 требует скрининга большого количества пептидов (т.е. пептидной библиотеки); однако тучные клетки трудно и дорого поддерживать in vitro и, следовательно, не экономично использовать для скрининга большого количества молекул. В настоящей статье демонстрируется способ проектирования, разработки и экранирования библиотеки небольших пептидных молекул с использованием MRGPRX2, экспрессивных HEK-клеток. Эта клеточная линия относительно проста и недорога в обслуживании и может быть использована для высокопроизводительного анализа in vitro. Чувствительный к кальцию флуоресцентный краситель Fura-2 для маркировки внутриклеточного потока кальция при активации использовался для мониторинга активации. Для расчета концентрации кальция использовалось отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при 510 нм к длинам волн возбуждения 340 и 380 нм. Пептидная библиотека, используемая для проверки этой системы, была основана на секретагоге эндогенного проадреномедуллина N-терминала 12 (PAMP-12), который, как известно, связывает MRGPRX2 с высокой специфичностью и аффинностью. Последующие пептиды были получены с помощью методов усечения аминокислот и аланина, примененных к PAMP-12. Метод, описанный здесь, прост и недорог, но при этом надежен для скрининга большой библиотеки соединений для идентификации связующих доменов и других важных параметров, которые играют важную роль в активации рецепторов.

Introduction

Тустовые клетки являются неотъемлемой частью иммунной системы и играют решающую роль как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Тучные клетки в основном активируются либо связыванием антигена с иммуноглобулином E (IgE) – рецепторным комплексом FcεRI, либо недавно обнаруженным mas-родственным рецептором G-белка-X2 (MRGPRX2)1. Активация MRGPRX2 была связана с несколькими иммунными и воспалительными заболеваниями, и, следовательно, важно понимать механизм связывания рецептора с его лигандами2. Для этого была разработана библиотека небольших пептидных молекул, которые были экранированы против рецепторов MRGPRX2, которые были чрезмерно экспрессированы в клетках HEK. В ходе исследования библиотека пептидов была построена с использованием простых и универсальных методов сканирования аланина и усечения аминокислот. Сканирование аланина включает в себя замену определенных аминокислот остатком аланина. Аланин, будучи малым и нейтральным, лишает пептид специфических свойств, придающихся замененным остатком, и последовательно подчеркивает значение соответствующих физико-химических свойств аминокислоты в рецепторных взаимодействиях. Напротив, при усечении аминокислот пептидные последовательности устроены таким образом, что в нем отсутствует один или несколько аминокислотных остатков от N-терминала, С-терминала или обоих. Этот набор пептидов был использован для идентификации аминокислотных последовательностей, имеющих решающее значение для связывания MRGPRX2.

Опыт работы с линиями тучных клеток человека (LAD-2) показал, что эти клетки трудно культивировать и поддерживать in vitro:время удвоения в две недели, дорогостоящие средние добавки и прямое внимание, требуемое во время пассажа3. Эти атрибуты делают клетки непригодными для крупномасштабного скрининга потенциальных лигандов. В настоящем описании стабильно трансфектированные HEK-клетки, экспрессивающие рецептор MRGPRX2 (HEK-X2), использовали для скрининга пептидной библиотеки1. Клетки HEK-293 широко используются и изучаются для гетерологии экспрессии поверхностных рецепторов из-за их высокой эффективности трансфекции, более быстрой скорости удвоения и необходимости культивирования недорогих средних добавок в лаборатории4. Протокол трансфекта клеточной линии HEK-293 был продемонстрирован и хорошо известен5. Клетки HEK-293, стабильно экспрессирующие рецептор MRGPRX2 (пассаж 13-19), были активированы пептидами, полученными посредством N-усечения, C-усечения, N+C-усечения и сканирования аланина1. В качестве контроля использовались клетки ДИКОГО ТИПА HEK (HEK-WT) (пассаж 16-21). Внутриклеточное высвобождение кальция при активации контролировали для изучения активации на основе MRGPRX2.

Активация клеток MRGPRX2 сопровождается цитозольной мобилизацией кальция. Это регулируемое внутриклеточное высвобождение кальция в тучных клетках регулируется поступлением кальция в хранилище (SOCE), координируемым молекулой стромального взаимодействия 1 (STIM1); и занимает центральное место в каскаде иммунного ответа6,7. Для определения внутриклеточной концентрации кальция были использованы различные методы, в том числе пластырные зажимы и флуоресцентные красители8. Из всех доступных методов широко используются флуорометрические красители кальция в конъюгации с различными методами обнаружения9. Два типа флуорометрических красителей, которые приобрели интерес, а именно: одноволновые красители, такие как Fluo-4, и логометрические красители с двойной длиной волны, такие как Indo -1 и Fura-2. Преимущество, которое приносят логометрические красители с двумя длинами волн по сравнению с одноволновые красители, заключается в том, что ратиометрические красители корректируют экспериментальные ошибки, такие как загрузка красителя, фотоотбеливание и фокусировка10,11.

Фура-2 ацетоксиметиловый эфир (Fura-2 AM) представляет собой проникающий в клетку зелено-флуоресцентный краситель, возбуждение которого смещается на более низкую длину волны при связывании кальция. Экспериментально Fura-2 возбуждается при 340 и 380 нм, в то время как излучение регистрируется на 510 нм. При связывании кальция интенсивность флуоресценции при 340 нм увеличивается, а интенсивность 380 нм уменьшается, как показано на рисунке 1. Данные представлены в виде отношения интенсивности флуоресценции после возбуждения при 340 нм (F340) к интенсивности после возбуждения при 380 нм (F380), т.е. F340/F380. Соотношение F340/F380 пропорционально внутриклеточному кальцию, значение которого может быть рассчитано по уравнению Гринкевича12. Поскольку флуоресцентный сигнал получается от возбуждения красителя на двух длинах волн (340 нм и 380 нм), отношение флуоресцентных сигналов корректируется для экспериментальных факторов, таких как загрузка красителя, утечка красителя, фотоотбеливание и плотность клеток.

Protocol

1. Проектирование и разработка библиотеки пептидов Чтобы идентифицировать лиганды рецептора MRGPRX2 тучных клеток на основе известного лиганда, т.е. PAMP-1213,выполните следующие действия. Генерация N-усеченной пептидной библиотеки путем усечения N-концевых ами…

Representative Results

Таблица 1 содержит пептидные последовательности, генерируемые путем терминального усечения аминокислот и сканирования аланина. Как показано в таблице 1, пептиднаяпоследовательность RKKWNKWALSR не содержит N-концевой фенилаланин (F) по отношению к своему родительскому PAMP-12…

Discussion

Передача сигналов кальция занимает центральное место в дегрануляции тучных клеток и широко используется в изучении взаимодействий рецептор-лиганд, идентификации лигандов и открытии лекарств14. MRGPRX2 является недавно обнаруженным рецептором тучных клеток, который, как был?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SR и LDU хотели бы отметить грант Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC и NSERC-Discovery для этого проекта.

Materials

Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal – acetyl group
C terminal – amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

Riferimenti

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).

Play Video

Citazione di questo articolo
Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

View Video