פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.
מתילטרנספראז חלבונים (PRMTs) מזרזים את העברת קבוצת מתיל לשאריות ארגינין של חלבוני מצע. משפחת PRMT מורכבת מתשעה חברים שיכולים לעשות מונומטילט או שאריות ארגינין סימטריות/א-סימטריות. מספר נוגדנים המזהים סוגים שונים של מתילציה ארגינין של חלבונים שונים זמינים; לפיכך, מתן כלים לפיתוח מבחני סמנים ביולוגיים של פעילות PRMT. מבחנים מבוססי נוגדנים PRMT מאתגרים בשל מצעים חופפים וספציפי נוגדנים מבוססי מוטיב. נושאים אלה ואת ההתקנה הניסיונית לחקור את מתילציה ארגינין שנתרם על ידי PRMTs בודדים נדונים. באמצעות הבחירה הקפדנית של המצעים הייצוגיים שהם סמנים ביולוגיים לשמונה מתוך תשעה PRMTs, תוכנן פאנל של מבחני פעילות PRMT. כאן, הפרוטוקולים עבור מבחנים תאיים כמותי מדידת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים של משפחת PRMT בתאים מדווחים. היתרון של השיטות המתוארות הוא הביצועים הפשוטים שלהם בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות. הספציפיות של המצע ואמינות הנוגדנים שנבחרו אומתו במלואן עם גישות של הפלה ודיכוי יתר. בנוסף להנחיות מפורטות של סמנים ביולוגיים ונוגדנים לבדיקה, מסופק גם מידע על השימוש באוסף תרכובות של כלי מעכבים עבור PRMTs.
מתילציה ארגינין הוא שינוי פוסט-תרגום חשוב המסדיר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-RNA, ובכך ממלא תפקיד חשוב בתהליכים תאיים שונים כגון שחבור טרום-mRNA, נזק ל- DNA, תגובת שעתוק ותת-תזוזה בתיווך גורמיגדילה 1,2. ארגינין הוא מתילציה על ידי חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) וכתוצאה מכך מונומתיל ארגינין (Rme1), דימתילרגינין אסימטרי (Rme2a), או דימתילרגינין סימטרי (Rme2s)3. בהתבסס על סוג המתילציה, PRMTs מסווגים לשלוש קבוצות: סוג I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ו- 8), אשר מזרז דימתילציה מונו ואסימטרית; סוג II (PRMT5 ו- PRMT9), אשר מזרז דימתילציה מונו וסימטרית; וסוג III (PRMT7), אשר יכול רק מונומתילאט ארגינין3.
בשל מספר גדל והולך של נוגדנים ספציפיים מתילציה ארגינין זמין מסחרית, פעילות PRMT ניתן למדוד באמצעות סופג המערבי. כתם מערבי מבוסס פלואורסצנטי הוא הטכניקה המועדפת על פני זיהוי chemiluminescent בשל טווח דינמי גדול יותר ליניאריות, רגישות גבוהה יותר, ומאפשרמולטיפלקסים 4. כדי לכמת את רמות המתילציה של החלבון, נדרשת נורמליזציה של אות המתילציה לרמות החלבון הכוללות. על ידי בחירת הנוגדנים לחלבון כולל ומתילציה שגדל במינים מארחים שונים (למשל, עכבר וארנב), ניתן להשתמש בנוגדנים משניים המסומנים בפלואורופורים שונים ואת האות לשני הנוגדנים ניתן לקבוע באותה רצועת מדגם. נוגדנים מתיל ארגינין פותחו כדי לזהות ולאפיין monomethylated, א-סימטרי, או חלבונים דימתילציה סימטרית שבו מתיל ארגינין נמצא בהקשר מסוים. מאז רוב PRMTs מתילאט גליצין- ומוטיבים עשירים ארגינין בתוך המצעים שלהם5, מספר נוגדנים הועלו עבור פפטידים המכילים monomethyl או אסימטרי, סימטרי דימתיל ארגינין-גליצין חוזר כגון D5A12, ASYM24, או ASYM25, ו SYM11, בהתאמה. נוגדנים אחרים מתיל ארגינין נוצרו נגד ספריית פפטיד המכילה דימתיל אסימטרי, סימטרי ומונומתיל ארגינין בהקשר חוזר המאפשר זיהוי של מתיל ארגינין בהקשרים מסוימים אלה6. יש גם מספר גדל והולך של נוגדנים המזהים סימן ארגינין ספציפי על חלבון יחיד המאפשר זיהוי סלקטיבי של מתילציה כגון histone H4R3me2a או BAF155-R1064me2a.
ישנם מספר מעכבי PRMT זמינים מסחרית, אשר יכול לשמש ככלים עבור מבחנים סלולריים PRMT. עם זאת, לא כולם מאופיינים ביסודיות סלקטיביות ואפקטים מחוץ ליעד וחלקם יש להשתמש בזהירות. הקונסורציום הגנומי המבני, בשיתוף עם מעבדות אקדמיות ושותפי פארמה, פיתח מעכבי PRMT חזקים, סלקטיביים וחוטמים לתאים (בדיקות כימיות) הניתנים לשימוש ללא הגבלות על ידי הקהילה המדעית. מידע על מעכבים אלה ניתן למצוא על https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics https://www.chemicalprobes.org/. בדיקות כימיות הן מעכבי מולקולה קטנה עם במבחנה IC50 או Kd < 100 nM, סלקטיביות פי 30 על חלבונים באותה משפחה, ופעילות תאית משמעותית ב 1 מיקרומטר. בנוסף, לכל בדיקה כימית יש אנלוגי כימי קרוב שאינו פעיל נגד היעד המיועד7,8,9,10,11,12.
מטרת פרוטוקול זה היא למדוד את הפעילות הסלולרית של בני משפחת PRMT בודדים בשיטת הכתם המערבי הפלואורסצנטי. כאן מסופקים מידע מפורט על סמנים ביולוגיים מאומתים, נוגדנים ומעכבים חזקים הפעילים בתאים, כמו גם אסטרטגיות יקרות ערך ליישום מוצלח של מבחני אחריות.
כאן מתוארים פרוטוקולי הבדיקה הסלולרית המפורטים לבני משפחת PRMT המשתמשים בשיטות סופגות מערביות פלואורסצנטיות. מצעים ייחודיים שעבורם ניתן לזהות בקלות את השינויים במתילציה של ארגינין על אובדן PRMT בודד או עיכוב קטליטי ולא ניתן לפצות אותם על ידי בני משפחה אחרים נבחרו. חלבונים מסוימים מתילציה על ידי PRMTs מרובים21,23, מציע חפיפה ספציפית מצע שבו כמה PRMTs לתרום רק כמות קטנה של סימן הסלולר במצע חלבון נתון24,25,26,27, למשל, הן PRMT8 ו PRMT1 לתרום מתילציה של EWS. לכן, כל בדיקה דרשה אימות יסודי של מצעים ונוגדנים עם ניסויי הפלה ו/או דיכוי יתר ואימות נוסף עם מעכבים סלקטיביים מאופיינים היטב. PRMT מצעים ספציפיים זוהו אשר שינויים סימן מתילציה ניתן לזהות בתוך 2-3 ימים לאחר PRMT הפסד / עיכוב, כדי למנוע השפעות הרכבה של הכדאיות התא מופחת התפשטות שעלולה להשפיע בעקיפין על רמות סימן מתיל ארגינין. למרות שניתן היה למצוא מצעים ייחודיים עבור PRMT1, 4, 5, 7 ו- 9; עבור PRMT3, 6, ו 8 הרווח של גישת פונקציה היה צריך להיות מועסק. מספר נוגדנים ספציפיים למתיל ארגינין נבדקו למטרות תאיות שונות, אך אף אחד מהם לא הצליח לזהות שינויים משמעותיים בתוך 3 ימים מהפלת PRMT3 ו- PRMT6; לכן, מבחני סמנים ביולוגיים פותחו באמצעות אנזימים מבוטאים חוץ רחמית יחד עם מוטנטים לא פעילים קטליטית, אשר שימשו כפקד על מתילציה מצע הבסיס. PRMT8 הוא הומולוג PRMT1 קרוב וחולק העדפות מצע דומות. כמו סמן ביולוגי סלקטיבי PRMT8 לא ניתן היה לזהות, הבדיקה בתאי ההפלה PRMT1 פותחה, שם PRMT8 הובע במשותף יחד עם EWS. PRMT1 הוא גם אנזים מרכזי האחראי על מתילציה אסימטרית H4R3, ולכן, להשתמש H4R3me2a כמו סמן ביולוגי עבור PRMT3 ו PRMT6 מבחנים הסלולר, תאים עם רמות נמוכות הבסיסית H4R3me2a נבחרו, כמו גם מוטציות לא פעילים קטליטי שימשו כבקרת רקע. למרות מבחנים אנדוגניים עדיפים, מבחנים אקסוגניים להוכיח לא יסולא בפז לבדיקת העוצמה התאית של מספר מעכבי PRMT סלקטיבי7,8,9. עם הידע הגובר של ביולוגיה PRMT, אנו מצפים לשפר את מבחני על ידי מציאת חלבונים סמנים ביולוגיים ספציפיים יותר עבור PRMT3, PRMT6, ו PRMT8.
השימוש בנוגדנים מאומתים ובקרות מתאימות הם קריטיים לביצועי מבחני PRMT. כל הנוגדנים המומלצים כאן קיבלו תוקף יסודי על ידי ניסויי הפלה ודיכוי יתר, עם זאת, הבדלי אצווה לאצווה, במיוחד במקרה של נוגדנים פוליקלונליים, עדיין עשויים להשפיע על הביצועים שלהם. לכן, חיוני להשתמש בשיטות גנטיות ובדיקות כימיות יחד עם הבקרות השליליות הקשורות קשר הדוק שלהם כדי לאשר את אמינות הבדיקה. בנוסף, עבור מבחני PRMT הדורשים ביטוי יתר של חלבון, חיוני להשתמש במוטנטים לא פעילים קטליטית יחד עם חלבון מסוג בר כדי לקבוע את רמות המתילציה הבסיסית.
אוסף זה של מבחנים כמותיים ליצירת פרופיל הפעילות של PRMTs בתאים יכול להיות שימושי באופן נרחב עבור הקהילה המדעית שכן ניתן ליישם אותו במהירות ובקלות עם ציוד מינימלי ומומחיות טכנית מוגבלת, הכוללת רק טכניקות בסיסיות של culturing תאים ו fluorescent המערבי סופג. הנוגדנים המומלצים ובדיקות כימיות עבור PRMTs יכולים לשמש גם עבור בדיקות פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) כדי לקבוע את ההתאמה של בדיקה ABPP נתון, לפקח על מעורבות היעד, ולהעריך את ההשפעות מחוץ ליעד באמצעות פורמט ABPP תחרותי. גישות פיתוח מבחני הדיון כאן יכולות גם להיות מעודנות עבור משפחות אנזימים אחרות כגון ליצין חלבון-מתילטרנספראזים ואצטילטרנספראזים.
The authors have nothing to disclose.
קונסורציום הגנומיקה המבנית הוא ארגון צדקה רשום (לא: 1097737) שמקבל כספים מ- AbbVie, באייר AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, גנום קנדה באמצעות מכון גנומיקה באונטריו [OGI-196], האיחוד האירופי ו- EFPIA באמצעות היוזמה לתרופות חדשניות 2 התחייבות משותפת [מענק EUbOPEN 875510], ינסן, מרק KGaA (aka EMD בקנדה ובארה”ב), פייזר, טקדה וקרן Wellcome [106169/ZZ14/Z
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |