这些协议提供了用于评估细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族中个体成员的酶活性的方法。详细介绍了使用内源性和外源性生物标志物、甲基-精氨酸识别抗体和抑制剂工具化合物评估PRMT活性的指南。
蛋白质甲基转移酶 (PRMTs) 催化甲基组向基质蛋白精氨酸残留物的转移。PRMT 家族由九名成员组成,可单体或对称/不对称地使用二甲基酸精氨酸残留物。有几个抗体识别不同类型的各种蛋白质的精氨酸甲基化:从而为PRMT活性生物标志物检测的发展提供了工具。PRMT 基于抗体的检测由于基材重叠和基于图案的抗体特异性而具有挑战性。讨论了这些问题以及研究单个PRMT所促成的精氨酸甲基化的实验设置。通过仔细选择具有代表性的基材,为九分之八的PRMT提供生物标志物,设计了一个PRMT活动检测小组。在这里,报告了以定量测量PRMT家族中单个成员在细胞中的酶活性而进行细胞检测的协议。上述方法的优点是它们在任何具有细胞培养和荧光西斑功能的实验室中都具有直接的性能。基板特异性和所选抗体可靠性通过击倒和过度表达方法得到充分验证。除了检测生物标志物和抗体的详细指南外,还提供了关于使用抑制剂工具为PRMT收集化合物的信息。
精氨酸甲基化是调节蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用的重要转化后修饰,因此在MRNA前拼接、DNA损伤、转录反应和生长因子介导1、2等各种细胞过程中发挥着重要作用。精氨酸是由蛋白质精氨酸甲基转移酶 (PRMTs) 导致单甲基精氨酸 (Rme1), 不对称二甲基金宁 (Rme2a), 或对称二甲基金素 (Rme2s)3.根据甲基化类型,PRMT分为三组:I型(PRMT1、2、3、4、6和8),它们催化单二元化和不对称二元化:II型(PRMT5和PRMT9),促进单二元化和对称二元化:和类型III(PRMT7),它只能单甲基酸酯精氨酸3。
由于越来越多的市售精氨酸甲基化特异性抗体,PRMT活性可以用西方印迹来测量。荧光为基础的西方污点是首选的技术比化疗检测,由于更大的动态范围和线性,更高的灵敏度,并允许多路复用4。要量化蛋白质甲基化水平,需要将甲基化信号正常化到总蛋白质水平。通过选择在不同宿主物种(如小鼠和兔子)中培养的总和甲基化蛋白的抗体,可以使用标有不同氟磷的二次抗体,并在同一样本带中确定两种抗体的信号。开发甲基-精氨酸抗体是为了识别和描述甲基化、不对称或对称的二甲基化蛋白质,其中甲基-精氨酸是在特定环境中发现的。由于大多数PRMT的基底5内含有甲基酸甘油和精氨酸丰富的图案,因此分别为含有单甲基或不对称、对称二甲基-精氨酸-甘氨酸重复的肽(如D5A12、ASYM24或ASYM25和SYM11)提出了若干抗体。其他甲基-精氨酸抗体产生于肽库中,该库含有不对称、对称的二甲基和单甲基精氨酸,在重复的语境中促进在这些特定环境中检测甲基-精氨酸6。也有越来越多的抗体,识别单一蛋白质上的特定精氨酸标记,使甲基化选择性检测,如高石H4R3me2a或BAF155-R1064me2a。
有几个市售的PRMT抑制剂,可以用作PRMT细胞测定工具。然而,并非所有这些都具有完全的选择性和偏离目标的效果,有些应谨慎使用。结构基因组联盟与学术实验室和制药合作伙伴合作,开发出具有良好特征的强效、选择性和细胞渗透性PRMT抑制剂(化学探针),科学界可以毫无限制地使用这种抑制剂。这些抑制剂的信息可以在 https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics 和 https://www.chemicalprobes.org/ 上找到。化学探针是小分子抑制剂,体外IC50或K d<100纳米,选择性超过同一家族蛋白质的30倍,细胞活性显著,为1μM。 此外,每个化学探针都有一个紧密的化学模拟,对预定目标7、8、9、10、11、12不活跃。
该协议的目标是使用荧光西斑法测量单个PRMT家庭成员的细胞活性。这里提供了有关验证的检测生物标志物、抗体和强效细胞活性抑制剂的详细信息,以及成功实施检测的宝贵策略。
在这里,详细的细胞检测协议为PRMT家族的成员描述,使用荧光西斑点方法。选择独特的基材,在单独的PRMT损失或催化抑制时很容易检测到精氨酸甲基化的变化,并且无法由其他家庭成员进行补偿。有些蛋白质是由多个PRMT21,23甲基化,这表明基质特异性重叠,其中一些PRMT只贡献少量细胞标记在给定的蛋白质基板24,25,26,27,例如,PRMT8和PRMT1有助于EWS的甲基化。因此,每次检测都需要通过击倒和/或过度表达实验对基板和抗体进行彻底验证,并进一步验证具有良好特征的选择性抑制剂。已确定PRMT特定基板,可在PRMT丢失/抑制后的2-3天内检测到甲基化标记变化,以避免可能间接影响甲基-精氨酸标记水平的细胞生存能力降低和增殖的复合效应。虽然有可能找到PRMT1、4、5、7和9的独特基材:对于PRMT3、6和8,必须采用功能增益方法。对几个精氨酸甲基特异性抗体进行了各种细胞靶点测试,但没有一种能够在PRMT3和PRMT6击倒后3天内检测出显著变化:因此,生物标志物检测是利用异位表达的酶与催化不活跃突变体一起开发的,作为基线基板甲基化的控制。PRMT8 是一个密切的 PRMT1 同源,并共享类似的基板偏好。由于无法识别PRMT8选择性生物标志物,因此开发了PRMT1击倒细胞中的检测方法,其中PRMT8与EWS共同表达。PRMT1 也是负责 H4R3 不对称甲基化的主要酶,因此,使用 H4R3me2a 作为 PRMT3 和 PRMT6 细胞测定的生物标志物,选择基底 H4R3me2a 水平低的细胞以及催化不活跃突变体作为背景控制。虽然内源性检测是首选,外源性检测证明对测试几个选择性PRMT抑制剂7,8,9的细胞效力是无价的。随着PRMT生物学知识的不断增长,我们期望通过为PRMT3、PRMT6和PRMT8找到更具体的生物标志物蛋白来改进检测。
使用经验证的抗体和适当的控制对PRMT检测性能至关重要。这里推荐的所有抗体都经过击倒和过度表达实验的彻底验证,但是,批次差异,特别是在多克隆抗体的情况下,仍然可能影响其性能。因此,使用遗传方法和化学探针及其密切相关的负控件来确认检测可靠性至关重要。此外,对于需要蛋白质过度表达的PRMT检测,使用催化不活跃突变体以及野生型蛋白质来确定基底甲基化水平至关重要。
这套用于分析细胞中PRMT活性的定量检测方法对科学界大有裨益,因为它可以以最少的设备和有限的技术专长快速、轻松地实施,仅涉及基本的细胞培养和荧光西方印迹技术。建议的PRMT抗体和化学探针也可用于基于活动的蛋白质分析(ABPP)检测,以确定给定ABPP探头的适用性,使用具有竞争力的ABPP格式监测目标参与度并评估目标外效应。这里讨论的检测开发方法也可以推断出其他酶家族,如蛋白莱辛-甲基转移酶和乙酰转移酶。
The authors have nothing to disclose.
结构基因组学联合会是一个注册慈善机构(不:1097737),从拜耳股份公司的艾伯维获得资金, 博林格·英格尔海姆、吉恩泰克、加拿大基因组通过安大略基因组研究所[OGI-196]、欧盟和EFPIA通过创新药物倡议2联合承诺[EUbOPEN赠款875510]、詹森、默克KGaA(加拿大和美国的EMD)、辉瑞、竹田和威康信托[106169/ZZ14/Z]。
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |