Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

A retina de vertebrados é um importante sistema modelo para o estudo do desenvolvimento neural. Apesar de sua localização periférica, a retina é anatômica e em desenvolvimento uma extensão do sistema nervoso central, e o nervo óptico, que consiste em axônios de células ganglionares da retina, representa um trato dentro do sistema nervoso central. A retina de pintinhos tem vantagens significativas como um sistema modelo para estudar o mecanismo molecular do desenvolvimento neural: é grande e se desenvolve rapidamente; tem semelhanças estruturais e funcionais com a retina humana; É altamente acessível para visualização e manipulações experimentais. Mecanismos moleculares de proliferação e diferenciação celular, morfogênese e orientação axonal durante o desenvolvimento neural têm sido extensivamente estudados usando a retina de galinha.

A eletroporação in ovo tem sido utilizada com sucesso nas últimas duas décadas para introduzir genes ectópicos em células do embrião de pintinhos em desenvolvimento. Esta técnica permite a marcação de células em desenvolvimento, o rastreamento do destino celular e o rastreamento da migração celular e dos tratos axonais, bem como a expressão gênica ectópica para análise in vivo da função gênica. As condições de eletroporação in ovo para a expressão gênica ectópica eficiente em embriões de pintinhos estão bem estabelecidas ^1,2,3.

Apesar dessas vantagens, a falta de uma técnica estável de perda de função para estudos da função gênica tem sido uma grande limitação técnica do embrião de pintinho. Enquanto embriões de pintinhos eletroporados com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)⁴ ou vetores de expressão para RNAs curtos (shRNAs)⁵ apresentam knockdown do gene alvo, a supressão gênica nessas abordagens é transitória porque os efeitos desaparecem quando as células perdem os RNAs ou DNAs introduzidos. Uma supressão gênica mais estável pode ser obtida pela entrega de siRNAs em embriões de pintos por um sistema de retrovírus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)⁶. O vetor viral integra-se ao genoma do hospedeiro, e os genes ectópicos são expressos de forma estável. No entanto, o retrovírus só pode se integrar ao genoma de células em divisão durante a fase mitótica (M) do ciclo celular, o que pode impor uma limitação nos estágios de desenvolvimento e/ou tipos celulares para os quais essa abordagem de perda de função pode ser aplicada. Além disso, a expressão de transgenes por RCAS parece mais lenta e menos robusta do que a induzida pela eletroporação in ovo ⁷.

Transposons são elementos genéticos que se movem de um local no genoma para outro. O elemento Tol2 é um membro da família de elementos transponíveis hAT e contém um gene interno que codifica uma transposase que catalisa a reação de transposon do elemento Tol2⁸. Quando um vetor plasmidial que carrega um de expressão gênica flanqueado pelas sequências das extremidades esquerda e direita dos elementos Tol2 (200 pb e 150 pb, respectivamente) é introduzido em células vertebradas com uma construção de expressão de transposase de Tol2, o de expressão é extirpado do plasmídeo e integrado ao genoma do hospedeiro, o que suporta uma expressão estável do gene ectópico (Figura 1). Tem sido demonstrado que o elemento transponível Tol2 pode induzir a transposição gênica de forma muito eficiente em diferentes espécies de vertebrados, incluindo zebrafish^9,10, rãs 11, pintos 12 e camundongos ¹³, sendo^, portanto, um método útil de transgênese e mutagênese insercional. O sistema transposon Tol2 tem sido usado com sucesso para knockdown condicional de um gene alvo por integração genômica de siRNA que é processado a partir de RNA de fita dupla longa¹⁴.

Este protocolo descreve uma abordagem de perda de função no embrião de pintinho que envolve a introdução de microRNAs artificiais (miRNAs) pelo sistema transposon Tol2^15,16. Nesta abordagem, um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e miRNAs artificiais contra um gene alvo é clonado em um vetor transposon Tol2. A construção transposon Tol2 é então introduzida na retina embrionária de pintos com uma construção de expressão transposase Tol2 por eletroporação in ovo. Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nossos estudos anteriores, derrubamos com sucesso a expressão de Nel, uma glicoproteína extracelular predominantemente expressa no sistema nervoso, na retina de pintinhos em desenvolvimento (ver Resultados Representativos). Nossos resultados indicam que a supressão gênica estável e eficiente pode ser alcançada em ovo por esta técnica.