פיתחנו פרוטוקול פשוט וזול לטעון Cas9 / מדריך יחיד RNA RNA (sgRNA) rbonucleoprotein מתחמים בתוך חלקיקים דמויי וירוס. חלקיקים אלה, הנקראים “Nanoblades”, מאפשרים העברה יעילה של קומפלקס Cas9/sgRNA בתאים מונצחים וראשוניים, כמו גם ב- vivo.
מערכת החזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)-Cas המקובצת באופן קבוע בין-מרחבית הפכה את עריכת הגנום לדמוקרטית בתאים אאוקריוטים והובילה לפיתוח יישומים חדשניים רבים. עם זאת, אספקת חלבון Cas9 ו- RNA חד-מדריך יחיד (sgRNA) לתאי היעד יכולה להיות אתגר מבחינה טכנית. וקטורים ויראליים קלאסיים, כגון אלה הנגזרים מ- lentiviruses (LVs) או וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs), מאפשרים אספקה יעילה של קידוד טרנסג’נים עבור חלבון Cas9 וה- sgRNA הקשור אליו בתאים ראשוניים רבים וב- vivo. עם זאת, וקטורים אלה יכולים לסבול מחסרונות כגון שילוב של הטרנסג’ן בגנום תא היעד, קיבולת מטען מוגבלת, וביטוי ארוך טווח של חלבון Cas9 ומדריך RNA בתאי היעד.
כדי להתגבר על חלק מהבעיות הללו, פותח וקטור אספקה המבוסס על נגיף לוקמיה מורין (MLV) כדי לארוז את חלבון Cas9 ואת RNA המדריך הקשורים אליו בהיעדר כל טרנסג’ן קידוד. על ידי היתוך חלבון Cas9 לטרמינל C של החלבון המבני Gag מ- MLV, נוצרו חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) עמוסים בחלבון Cas9 וב- sgRNA (הנקראים “Nanoblades”) . Nanoblades ניתן לאסוף ממדיום התרבות של תאים מפיקים, מטוהר, מכמת, ומשמש כדי transduce תאי היעד ולספק את קומפלקס Cas9 / sgRNA הפעיל. ננו-בלידים מספקים את מטען הריבונוקלאופרוטאין (RNP) שלהם באופן ארעי ומהיר במגוון רחב של תאים ראשוניים ומונצחים וניתן לתכנת אותם עבור יישומים אחרים, כגון הפעלה שעתוק חולפת של גנים ממוקדים, באמצעות חלבוני Cas9 מותאמים. Nanoblades מסוגלים בעריכת גנום vivo בכבד של עכברים בוגרים מוזרקים בביציות כדי ליצור בעלי חיים מהונדסים. לבסוף, הם יכולים להיות מורכבים עם DNA תורם עבור “ללא טרנספקטיה” תיקון הומולוגי מונחה. הכנת Nanoblade היא פשוטה, בעלות נמוכה יחסית, והוא יכול להתבצע בקלות בכל מעבדה לביולוגיה של התא.
בהשוואה לנוקלאזים ניתנים לתכנות אחרים, מערכת CRISPR-Cas פישטה באופן דרמטי ודמוקרטיזציה של ההליך של פילוח גנום ספציפי לרצף ומחשוף בתאים אאוקריוטים. באמצעות הביטוי הפשוט של sgRNA, משתמשים יכולים לתכנת את חלבון Cas9 (או גרסאות ממוטבות) עבור כמעט כל לוקוס תאי1. בתרחיש זה, משלוח של חלבון Cas9 ו sgRNA הופך את המגבלה העיקרית בעת ביצוע mutagenesis מכוון לאתר. בתאים מונצחים, ניתן לבטא בקלות את ה- sgRNA ואת חלבון Cas מפלסמידים שעברו טרנספוזידים כדי להשיג מיקוד גנום יעיל ברוב התאים. עם זאת, ביטוי מכונן של קומפלקס Cas9/sgRNA יכול להגביר את הפעילות מחוץ למטרה של חלבון Cas9 ולהציג שינויים לא רצויים ב- loci2 לא ספציפי. בתאים ראשוניים, טרנספקטיבה DNA יכול להיות קשה מבחינה טכנית להשיג ולהוביל ביטוי לקוי או אחוז קטן של תאים transfected. חלופות לטרנספקטיה קלאסית של דנ”א כוללות שימוש בווקטורים ויראליים המספקים קידוד טרנסג’ן עבור Cas9 ו- sgRNA או אלקטרופורציה של חלבון Cas9 רקומביננטי בשילוב עם sgRNA סינתטי. עם זאת, גישות אלה יכולות להוביל לשילוב טרנסג’ן בתוך הגנום המארח של התא (כמו במקרה של וקטורים קלאסיים של ביטוי רטרו-ויראלי ולנטי-ויראלי), הגבלה על ידי גורמים תאיים, ולהוביל לביטוי מכונן של חלבון Cas9 ו- sgRNA.
אלקטרופורציה של קומפלקס Cas9/sgRNA RNP יכולה להתגבר על רוב הבעיות הללו ולהוביל לאספקה יעילה וחולפת בתאים הראשיים וב- vivo, כמו גם לאפשר תגובה תלוית מינון. עם זאת, זה בדרך כלל מסתמך על ציוד יקר ריאגנטים והוא גם קשה לשדרג אם מספר רב של תאים צריך להיות מטופלים. כחלופה לטכניקות הנ”ל, מחברים אלה פיתחו את “Nanoblades” – וקטור אספקה רטרו-ויראלי עבור חלבון Cas9 ו- sgRNA3 הדומה מבחינה רעיונית למערכות אחרות להעברת חלבונים קפסידים שמקורן בנגיף4,5,6,7,8. Nanoblades לנצל את היכולת הטבעית של פוליפרוטאין Gag מן retroviruses לייצר, כאשר לידי ביטוי לבד בתאים בתרבית, VLPs המשוחררים במדיום חוץ תאי9. על ידי היתוך חלבון Cas9 לקצה מסוף C של נגיף לוקמיה מורין (MLV) פוליפרוטאין Gag וביטוי משותף של sgRNA וגליקופרוטינים של מעטפה ויראלית, חלבון Cas9 יכול להיות אנקפסולציה בתוך VLPs שוחררו או Nanoblades. עם הטיהור, Nanoblades ניתן לדגור עם תאי היעד או מוזרק ויוו כדי לתווך מסירה מהירה, חולפת, ותלויה במינון של Cas9 / sgRNA RNP קומפלקס3.
Nanoblades ניתן לתכנת עם sgRNAs מרובים לעריכה בו זמנית ב loci שונים או עם וריאנטים Cas9 לבצע יישומים אחרים כגון הפעלה תמלול ספציפית ליעד או דיכוי3. בניגוד לאלקטרופורציה של חלבונים, המסתמכת על ביטוי רקומביננטי, ניתן לשכפל בקלות גרסאות Cas המתוארות לאחרונה מהספרות לווקטור ביטוי היתוך Gag, מה שהופך אותו לפלטפורמה רב-תכליתית. Nanoblades יכול להיות מורכב עוד יותר או טעון עם אוליגודודאוקסינוקלאוטידים חד גדילים כפולים (ssODNs) כדי לבצע תיקון מונחה הומולוגיה3. ייצור Nanoblade הוא יחסית פשוט וזול. יתר על כן, Nanoblades ניתן לאחסן ב 4 °C (4 °F) במשך ימים רבים או ב -80 °C (80 °F) לאחסון לטווח ארוך. בדרך כלל, Nanoblades מתווכים יעיל, עריכת גנום ללא טרנסג’ן בתאים התרבותיים המונצחים והראשוניים ביותר. עם זאת, תאים ראשוניים מסוימים עשויים להיות רגישים לנוכחות של חלקיקים ויראליים, וכתוצאה מכך תמותה מוגברת. תאים של המערכת החיסונית המולדת יכולים גם להגיב לנוכחות של Nanoblades (בגלל מוצאם הנגיפי) ולהיות מופעלים. במקרים אלה, פרוטוקול transduction צריך להיות ממוטב כדי להגביל את זמן החשיפה Nanoblades ולמזער השפעות לא ספציפיות. Nanoblades מייצגים חלופה מעשית וקלה ליישום לשיטות משלוח CRISPR זמינות אחרות.
Nanoblades לאפשר משלוח מהיר ותלוי במינון של קומפלקס Cas9/ sgRNA RNP בשורות התא ותאים ראשיים. בניגוד לטרנספקטיה קלאסית וקטורים ויראליים אחרים, אך בדומה לאלקטרופורציה של חלבונים, לננובלאדים יש את היתרון של משלוח ארעי של Cas9/sgRNA RNP באופן נטול טרנסג’ן. Nanoblades מציעים פלטפורמה רב-תכליתית, פשוטה וזולה ביותר לאספקת חלבונים שניתן להתאים בקלות ובמהירות למשפחה ההולכת ומתרחבת של גרסאות CRISPR. Nanoblades ניתן לייצר בקו התא HEK293T או נגזרותיו. קווי תאים HEK293T המשמשים כאן פותחו כדי למקסם את ייצור החלקיקים הרטרו-ויראלי והרטי-ויראלי (ראו טבלת החומרים). עם זאת, למרות מקורות אחרים של תאי HEK293T עשויים להיות מתאימים, משתמשים חייבים לבדוק ולהשוות תאי HEK293T ממקורות שונים כמו הבדלים עיקריים בייצור חלקיקים נצפו בהתאם למקור התא HEK293T. תאים צריכים גם להיבדק לזיהום Mycoplasma לעתים קרובות ועבר כל שלושה ימים (קלאסי 1/8 דילול) כדי למנוע עומס יתר, אשר יש השפעה שלילית על ייצור חלקיקים.
תאים לא צריכים להיות מתוחזקים במשך מעל 20 קטעים. DMEM בתוספת גלוקוז, פניצילין/סטרפטומיצין, גלוטמין, ו-10% סרום בקר עוברי מפורק שימש לתרבות תאים. כמו מקור סרום עשוי להשפיע על איכות ההכנה Nanoblade, אצוות שונות של סרום צריך להיבדק לפני ייצור בקנה מידה גדול. Nanoblades יכול להיות מיוצר ביעילות במדיה אחרת כגון RPMI או שינויים ללא סרום של מדיום חיוני מינימלי שיכול להחליף DMEM ביום שלאחר טרנספקטיבה. כפי שצוין להלן, למרות החלפה בינונית לאחר transfection עם כמה ריאגנטים DNA-transfection הוא אופציונלי, זה עשוי להיות מועיל לשנות את המדיום שבו VLPs משוחררים, במיוחד כדי להגביל את עקבות סרום בהכנת החלקיקים. עם זאת, טיפוח תאים במדיום חיוני מינימלי בסרום מופחת ביום שלפני הטרנספוזיציה עדיין לא נוסה.
כאמור, Nanoblades מיוצרים על overexpression של תערובת של פלסמידים בתאי היצרן. נראה כי ביטוי היתר נדרש לייצור אופטימלי. ואכן, מעבדה זו פיתחה קו תאים מפיק שבו המבנה המבטא Gag-Pol התייצב על ידי בחירת אנטיביוטיקה; עם זאת, מערכת זו נכשלה לייצר כמויות משמעותיות של Nanoblades. תצפית דומה נעשתה כאשר מבנה קידוד sgRNA שולב ביציבות בגנום של תאי היצרן. כפי שתואר עבור מערכות ייצור חלקיקים אחרות, קו תאים יציב המבטא לפחות כמה מבנים המעורבים בייצור Nanoblades עשוי להיות שימושי; עם זאת, זה בהחלט ידרוש עיבוד של כמויות גדולות של supernatant וטכניקה מתאימה כדי לטהר חלקיקים. הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך המועדף לייצור Nanoblades המנצל ריאגנטים טרנספקטים ספציפיים (ראה טבלת החומרים).
למרות ריאגנטים transfection מיצרני אחרים נבדקו גם בהצלחה, הרוב המכריע של תוצאות קבוצה זו עם Nanoblades בצע את ההליך המתואר בזאת. טרנספקטיה בעלות נמוכה ניתן להשיג באמצעות ריאגנטים סידן פוספט ולהניב יעילות ייצור טובה; עם זאת, שיטה זו בהחלט דורשת החלפת מדיום transfection ביום שלאחר transfection ועלול להשאיר שאריות סידן פוספט בהכנת חלקיקים משקעים. עולה בקנה אחד עם הצורך של רמות ביטוי גבוהות עבור רכיבי Nanoblade בתוך תאים מפיקים היא התצפית כי כמות sgRNAs הקשורים חלבון Cas9 יכול להיות גורם מגביל לעריכת גנום יעילה. כדי לשפר את טעינת sgRNA, שתי גישות טכניות פותחו לאחרונה על ידי קבוצות עצמאיות באמצעות וקטורים אספקת חלבון דומה Nanoblades. אלה מסתמכים על השימוש בביטוי ציטופלסמי תלוי פולימראז T7 של sgRNA6 או באמצעות תוספת של אות אנקפזיציה רטרו-ויראלי לרצף sgRNA כדי לתווך כריכה לפוליפרוטאין Gag6. גישות אלה אכן יכול לשפר את טעינת sgRNA בתוך Nanoblades למרות שהם לא נבדקו עדיין.
טרנסדוקציה של תאי יעד היא צעד קריטי בהליך. ברוב קווי התאים המונצחים, לתמרה עם Nanoblades יש השפעה ציטופתית מועטה, אם בכלל. עם זאת, בתאים ראשוניים, רעילות יכולה להיות בעיה. לפיכך, יש למטב את ההמרה עבור כל סוג תא. באופן ספציפי, זמן החשיפה Nanoblades הוא גורם חשוב לשנות בעת אופטימיזציה של פרוטוקול transduction. עבור תאים רגישים כגון נוירונים ראשוניים או תאי מח עצם, 4-6 שעות של דגירה עם Nanoblades לפני החלפת המדיום מאפשר משלוח יעיל של חלבון Cas9 תוך מזעור רעילות התא. יתר על כן, אדג’ובנטים כגון פולימרים קטיוניים, בין היתר, יכולים לשפר באופן משמעותי את היעילות של transduction בתאים מסוימים (ראה את טבלת החומרים). חשוב לציין כי Nanoblades הם VLPs והוא יכול לגרום לתגובה אימונוגנית. זה יכול להיות מגבלה אם עובדים עם סוגים מסוימים של תאים ראשוניים, כגון מקרופאגים או תאים דנדריטיים, שבהם דגירה עם Nanoblades יכול לגרום לשינויים חשובים בביטוי הגנים ואת פנוטיפ של התאים. אם מקרופאגים ותאים דנדריטיים נגזרים ממבשרי תאי גזע hematopoietic (כגון תאי מח עצם עכבר), עדיף להעביר תאים עם Nanoblades לפני שהם מובחנים לחלוטין כדי למנוע גרימת תגובה תאית נגד Nanoblades. אחרת, אלקטרופורציה של חלבון Cas9 יכולה לייצג חלופה מעשית בעת עבודה עם תאים חיסוניים מובחנים.
Nanoblades ניתן להשתמש vivo כדי להמרת זיגוטים עכבר או עוברים כדי ליצור בעלי חיים מהונדסים. בדומה לווקטורים רטרו-ויראליים קלאסיים או lentiviral, הם יכולים גם להיות מוזרקים ישירות לתוך רקמות מבעלי חיים בוגרים. עם זאת, Nanoblades (בדומה לווקטורים רטרו-ויראליים ו lentiviral) יכול להיות מושבת על ידי התגובה החיסונית של החיה המארחת; לפיכך, המינון שיש להזריק צריך להיות ממוטב עבור כל יישום. תגובה חיסונית זו יכולה גם להגביל את ההתפלגות של VLPs פונקציונליים לרקמות קרוב לאתר ההזרקה. לבסוף, שלא כמו וקטורים lentiviral, Nanoblades הם ללא transgene ולספק את Cas9 במסגרת זמן מוגבלת. לכן, הם לא יכולים לשמש לביצוע הקרנות פונקציונליות ברחבי הגנום הדורשות רצף תפוקה גבוהה של sgRNAs על בחירת תאים. Nanoblades שימושיים כאשר נדרשת עריכת גנום מהירה, תלוית מינון וטרנסג’ן20. יתר על כן, בדומה אלקטרופורציה חלבון, Nanoblades להוביל פחות השפעות מחוץ למטרה מאשר ביטוי ממושך של Cas9 / sgRNA באמצעות טרנספקטיה DNA או וקטורים ויראליים קלאסיים3. פיתוח עתידי של Nanoblades מתמקד בשילוב וריאנטים Cas9 עבור יישומים טכנולוגיים שונים כגון עריכת בסיס ומיקוד RNA.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) של אוניברסיטת ליון, במסגרת התוכנית Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) המופעלת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ33306) ועל ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-StG-LS6-805500 ל- E.P.R.) במסגרת תוכניות המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |