该协议描述了小鼠 神经视网膜的细胞图外植,与视网膜色素上皮(RPE)一起在R16定义的介质中培养,不含血清和抗生素。与 体内 实验相比,这种方法性能相对简单、成本更低、耗时,可适应多种实验应用。
在眼科研究中,神经神经内膜的 体外 模型非常需要。在这里,我们提出了一个详细的协议,为细胞图培养小鼠 神经视网膜与完整的视网膜色素上皮(RPE)。根据研究问题,视网膜可以从野生类型的动物或疾病模型中分离出来,例如研究糖尿病视网膜病变或遗传性视网膜退化。产后早期2-9动物的眼睛在无菌条件下被诱导。它们部分被消化在蛋白酶K中,以便将胆汁从RPE中分离。在立体镜下,角膜形成一个小切口,形成两个边缘,从其中胆汁和硬骨可以轻轻地从 RPE 和神经精子剥离。然后,将镜头拆下,眼杯切成四点,使其具有四楔形,类似于三叶草叶。组织最终被转移到一个挂滴到细胞培养插入持有聚碳酸酯培养膜。然后,这些培养物在R16介质中保持,没有血清或抗生素,在完全定义的条件下,每隔一天发生一次中等变化。
所述程序使小膜能够隔离,并维持其正常的生理和组织背景,至少持续2周的培养期。这些功能使有机视网膜外植培养成为具有高预测价值的优秀模型,用于研究视网膜发育、疾病机制和电生理学,同时实现药理学筛查。
在眼科研究中,有多种模型可用于研究视网膜,包括原发性视网膜细胞培养、视网膜衍生细胞系、视网膜器官,以及体内动物模型1、2、3、4、5。然而,这些模型中的每一个都有缺点。例如,细胞在孤立中生长,而网膜是一个复杂的网络,具有多种细胞对细胞的相互作用。因此,与整个组织中观察到的行为相比,孤立细胞培养的行为可能是人为的。这个问题可以部分地用体外分化视网膜器官来补救,可用于研究发育和基础生物学6。然而,从今天起,视网膜器官的生成仍然是耗时的,劳动密集型的,并遭受可重复性问题,需要大量的进一步发展工作之前,器官可用于转化视网膜研究。最后,对活体动物的研究,虽然可以说是最接近眼科研究要求的模型,但与强烈的伦理问题有关。细胞培养系统的效率与体内动物模型的真实情况之间的一个很好的折衷方案是有机视网膜外植培养。这种文化也减少了动物的痛苦,因为没有进行体内干预。
已经描述了几种方法来培育来自不同物种5,7,8的视网膜外植。我们的协议描述了一种隔离小鼠神经神经质及其视网膜色素上皮(RPE)的技术。这项技术也将适合大鼠视网膜培养9。神经神经质培养及其 RPE 对于成功至关重要。RPE对视网膜具有基本功能:输送养分、离子、水、吸收光线和防止光氧化,将全跨视网膜重新异构成11-cis-视网膜,这对视循环、棚光感受膜的幻象形成以及视网膜结构完整性的基本因素分泌至关重要。维护 RPE 可成功开发光感受器的外部和内部部分,使光网膜在较长时间内保持活力。下文描述的程序至少保存了两个星期12的直肠组织和生理特征。此外,在无血清、无抗生素的介质中培养有机视网膜外植可避免存在未知物质,并能够直接解释结果12。
有机视网膜外植培养对于提高我们对视网膜发育和退化的知识至关重要。我们在这里表明,它们也是药理学筛查的有用工具,它们可以用来模拟各种视网膜疾病,包括糖尿病视网膜病变。
所提交的协议描述了小鼠网状体的有机去除培养物,在定义的R16介质中具有完整的RPE,不含血清和抗生素。该协议最初开发于20世纪80年代末7,28,从那时起,它一直在不断完善6,11,12。值得注意的应用包括研究遗传性视网膜退化的机制和视网膜保护药物的鉴定23,29,30。
要想进行成功的实验,需要考虑一些重要的考虑因素。这里有一些重要的故障排除点,以帮助提高文化的质量。首先,视网膜文化可能表现出过度折叠和/或玫瑰花环形成31。这可以通过在去除过程中用钳子触摸直膜引起。此外,必须从除法植物中完全去除胆体,因为这样可以增加培养过程中的视网膜折叠。其次,在将小雷管转移到井板的悬垂滴中,如果网状网膜朝下面朝下,将其放在悬挂在移液器尖端的掉落处,并非常轻轻地将介质推入和推出尖端(无需分离悬垂滴)以翻转网状体。最后,如果 RPE 仍然附着在囊泡上,并且从网状网膜上分离,则很可能是由于硬盘消化不足造成的。在与来自老动物或非啮齿动物(如猪)的眼睛一起工作时,这个问题可能特别重要,并且可以通过增加蛋白酶K浓度来解决。
进行有机视网膜外植培养是一个复杂的过程,需要充分的培训和经验。缺乏培训可能导致视网膜外植质量的变异。出于这些原因,必须监测和验证可行性和可重复性,例如,用 TUNEL 检测来描述细胞死亡率。使用无抗生素介质使视网膜外植物容易受到细菌和真菌的污染。为了尽量减少这种风险,我们建议在真正无菌的条件下特别小心工作。 体外视网膜培养的另一个限制是与 体内 视网膜(例如,胆囊和视网膜供血、氧气和葡萄糖水平、眼内压力、体外组成)相比,物理化学环境的差异。一个连续的灌注系统,也许嵌入到一个专门的生物反应器32可以使这个模型更接近 体内 的条件。此外,视网膜解剖期间视神经的轴切除术会导致结节细胞死亡,从而诱发应激反应8。因此,建议在受特定操作或治疗之前,让去种植物 在体外 至少2天适应栽培条件。
上述方法通常在不成熟的视网膜组织上进行,在体外7、33中存活4周。然而,该程序是针对各种应用量身定制的,包括成人直膜的培养。虽然不同已发布的方法描述的成人视网膜的隔离没有其RPE34,35, 孵化与木瓜蛋白溶液长达1小时在37 °C之前解剖允许RPE保持连接到视网膜,即使来自成人小鼠36.
无血清介质和化学定义的体外环境为完全定义和可重复的实验条件提供了操作。因此,有机视网膜外植培养是眼科和神经科学领域的宝贵工具,曾用于研究视网膜疾病37、视网膜发育38、39、视网膜干细胞治疗40、基因改造41和药理筛选。作为药物测试的一个具体例子,在这里我们使用视网膜外植培养物来测试cGMP模拟(CN003),已知可以减少遗传视网膜疾病动物模型中的光感受细胞死亡23(图3B)。该技术的另一个可能应用在图3C中描述,它说明了如何利用组织环境的精确控制来模拟糖尿病状况24。由于在整个培养期组织结构的保存,有机视网膜外植培养也适合电生理学研究。使用补丁夹记录42和多电极阵列(MEA)记录33,43对视网膜外植物的神经元功能进行了研究。后者允许同时记录神经元人群的电活动,并利用它来描述培养条件下的光接受器和结节细胞功能。从更广的角度看,有机外植培养系统也可以应用于临床前研究,其中外植培养用于测试体温过低44的疗效。
有机体外植培养技术相对简单,与 体内 实验相比,成本更低,耗时更短,避免了与活体动物研究相关的伦理问题。对实验条件的精确控制以及RPE和组织复杂性的保存,使该方法成为提高我们对视网膜生理学和病理生理学知识的宝贵工具,并能够进行大量实验应用。
The authors have nothing to disclose.
这项研究工作得到了欧盟的资助。H2020-MSCA-765441),德国研究理事会(DFG;PA1751/8-1,10-1)和中国奖学金委员会。
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |