JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği

Published: February 06, 2021
doi:
10.3791/61749
, , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology,Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine,University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Burada bakteriyel endoftalmitin fare modelinde intravitreal enjeksiyon ve sonraki bakteriyel nicel bir yöntem tanımladık. Bu protokol, konak bağışıklık yanıtlarını ve bakteriyel ve konak gen ekspresyonunu ölçmek için genişletilebilir.

Abstract

Göz içi bakteriyel enfeksiyonlar görme için bir tehlike vardır. Araştırmacılar, uygun terapötik hedefleri belirlemek ve körlüğü önlemek için ilaçları test etmek için, konak ve bakteriyel faktörleri ve enfeksiyonla ilişkili bağışıklık yanıt yollarını araştırmak için hayvan modellerini kullanırlar. Intravitreal enjeksiyon tekniği organizmalar, ilaçlar veya diğer maddeler doğrudan gözün arka segmentinde vitreus kavite içine enjekte etmek için kullanılır. Burada, fare gözüne enfeksiyonu başlatmak için bu enjeksiyon tekniğini ve göz içi bakterileri ölçme tekniğini gösterdik. Bacillus cereus beyin kalp infüzyon sıvı ortamda 18 saat boyunca büyüdü ve bir konsantrasyon 100 koloni oluşturan birimleri (CFU)/0.5 μL için yeniden askıya alındı. Bir C57BL/6J fare ketamin ve ksilazin kombinasyonu kullanılarak anestezi edildi. Pikolitre mikroenjektör ve cam kılcal iğneler kullanılarak Fare gözünün orta vitreusuna Bacillus süspansiyonunun 0.5°L’si enjekte edildi. Kontralateral kontrol gözüne steril ortam (cerrahi kontrol) enjekte edildi ya da enjekte edilmedi (mutlak kontrol). Enfeksiyon sonrası 10 saat fareler ötenazi yapıldı ve gözler steril cerrahi cımbız kullanılarak hasat edildi ve 400 μL steril PBS ve 1 mm steril cam boncuk içeren bir tüpiçine yerleştirildi. ELISA veya miyeloperoksidaz tahlilleri için tüplere proteinaz inhibitörü eklenmiştir. RNA ekstraksiyonu için uygun lisis arabelleği eklendi. Gözler bir doku homogenizer 1-2 dakika homojenize edildi. Homojenatlar PBS’de 10 kat seri olarak seyreltildi ve agar plakaları üzerine seyreltildi. Homojenlerin geri kalanı ek tahliller için -80 °C’de saklandı. Plakalar 24 saat boyunca kuluçkaya yatırıldı ve göz başına CFU ölçüldü. Bu teknikler fare gözlerinde tekrarlanabilir enfeksiyonlara neden olur ve canlı bakterilerin nicelliğini kolaylaştırır, konak immün yanıt, konak ve bakteriyel gen ekspresyonunun omikleri.

Introduction

Bakteriyel endoftalmit inflamasyona neden olan yıkıcı bir enfeksiyondur, ve, düzgün tedavi edilmezse, görme veya körlük kaybına neden olabilir. Endophthalmitis göz iç içine bakteri girişi sonuçları1,2,3,4,5. Bir kez göz, bakteri çoğaltmak, toksinler ve diğer zararlı faktörler üretmek, ve hassas retina hücreleri ve dokularda geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. Göz hasarı da inflamasyon neden olabilir, göz iç içine inflamatuar hücre akını yol açan inflamatuar yolların aktivasyonu nedeniyle1,5,6. Endophthalmitis göz içi cerrahisi (post-operatif), göz (post-travmatik) bir delici yaralanma, ya da farklı bir anatomik siteden göze bakterilerin metastatik yayılması (endojen)7,8,9,10aşağıdaki oluşabilir. Bakteriyel endoftalmit için tedaviler antibiyotikler içerir, anti-inflamatuar ilaçlar, veya cerrahi müdahale3,4,11. Bu tedaviler bile, görme veya göz kendisi kaybolabilir. Bakteriyel endoftalmit sonrası görsel prognoz genellikle tedavi nin etkinliğine, sunumdaki görme keskinliğine ve enfekte organizmanın virülansına bağlı olarak değişir.

Bacillus cereus (B. cereus)travma sonrası endoftalmit 7,12neden olan başlıca bakteriyel patojenlerden biridir. B. cereus endophthalmitis olgularının çoğunda hızlı bir seyir izlenir ve bu da birkaç gün içinde körlüğe neden olabilir. B. cereus endophthalmitis özellikleri hızla gelişen göz içi iltihabı, göz ağrısı, görme keskinliği hızlı kaybı, ve ateş içerir. B. sereus yaygın göz enfeksiyonları 2 neden diğer bakterilere göre gözde hızla büyür2,4,12 ve birçok virülans faktörleri sahip. Bu nedenle, başarılı terapötik müdahale için pencere nispeten kısa1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Bu enfeksiyon için tedaviler genellikle diğer daha az öldürücü patojenlerin neden olduğu endophthalmitis tedavisinde başarılı, ancak B. cereus endophthalmitis genellikle önemli görme kaybı muzdarip hastaların% 70’inden fazla sonuçlanır. Buhastaların yaklaşık% 50 enfekte göz7,16,22,23evisceration veya enükleasyon geçmesi . B. cereus endophthalmitis yıkıcı ve hızlı doğası acil ve uygun tedavi için çağırır. Hastalık gelişiminin altında yatan mekanizmaların ayırt son ilerleme müdahale için potansiyel hedefler tespit ettik19,26,27. B. cereus endophthalmitis deneysel fare modelleri enfeksiyon mekanizmaları ayırt ve görme kaybını önleyebilir potansiyel terapötik test yararlı olmaya devam etmektedir.

B. cereus ile farelerin deneysel göz içi enfeksiyonu bakteriyel ve konak faktörleri anlamak için araçsal bir model olmuştur, yanı sıra etkileşimleri, endoftalmit sırasında28. Bu model, bir yaralanma sırasında bakterilerin göze sokulan post-travmatik veya postoperatif bir olayı taklit eder. Bu model son derece tekrarlanabilir ve deneysel tedavilertest etmek ve bakım standart iyileştirmeler için veri sağlamak için yararlı olmuştur1,6,19,29,30. Diğer birçok enfeksiyon modeli gibi, bu model enfeksiyon birçok parametre bağımsız kontrol sağlar ve enfeksiyon sonuçlarının verimli ve tekrarlanabilir incelenmesini sağlar. Son birkaç on yıl içinde tavşan benzer bir model çalışmaları gözde B. cereus virülans faktörlerin etkilerini inceledik2,4,13,14,31. B. cereus mutant suşları bireysel veya birden fazla virülans faktörleri eksik enjekte ederek, hastalık şiddetine bu virülans faktörlerin katkısı postenfeksiyon farklı saatlerde bakteri konsantrasyonu veya görsel fonksiyon kaybı13,14,27,31,32gibi sonuçlar ile ölçülebilir. Buna ek olarak, host faktörler belirli inflamatuar konak faktörleri26,29,33,34,35eksik nakavt fare suşları enfekte tarafından bu modelde incelenmiştir . Model aynı zamanda enfeksiyon dan sonra göze yeni bileşikler enjekte ederek bu hastalık için potansiyel tedavileri test etmek için yararlıdır30,36. Bu yazıda, bir fare gözünü B. cereusile enfekte etmeyi, enfeksiyon sonrası gözü niçin hasat etmeyi, göz içi bakteri yükünü nisbeten ölçmeyi ve hastalığın şiddetinin ek parametrelerini test etmek için numunelerin korunmasını içeren ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz.

Protocol

Tüm işlemler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ile Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği’nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildirim’deki tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numaraları 15-103, 18-043 ve 18-087) tarafından onaylanmıştır. 1. Steril cam iğneler İğne <stron…

Representative Results

Tekrarlanabilir bir inokül ve intravitreal enjeksiyon prosedürüdoğruluğu üreten mikrobiyal endoftalmit modelleri geliştirmede önemli adımlardır. Burada, Gram-pozitif Bacillus cereuskullanarak intravitreal enjeksiyon prosedürü gösterdi. Beş C57BL6 farenin orta vitreusuna 100 CFU/0.5 μL B. sereus enjekte ettik. 10 saat sonrası enfeksiyon sonrası B. sereus’un göz içi büyümesini yaklaşık 1.8 x 105 CFU/göz olarak gözlemledik. Şekil 1,</strong…

Discussion

Güçlü antibiyotikler, anti-inflamatuar ilaçlar ve vitrektomi cerrahisi durumu bile, bakteriyel endofalmit bir hasta kör olabilir. Klinik çalışmalar endofalmit in incelenmesinde yararlı olmuştur; ancak, endoftalmit deneysel modelleri, bakım standardında ilerlemeye çevrilebilen hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve bu da hastalar için daha iyi görsel sonuçlar sağlar.

Fare gözünün vitreus hacmi yaklaşık 7 μL40’tır. Bu küçük hacim sadece…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Dr Feng Li ve Mark Dittmar (OUHSC P30 Canlı Hayvan Görüntüleme Çekirdek, Dean A. McGee Göz Enstitüsü, Oklahoma City, Tamam, ABD) yardımları için teşekkür ederiz. Araştırmamız Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ve R01EY024140. Araştırmamız ayrıca P30EY21725 (Canlı Hayvan Görüntüleme ve Analizi, Moleküler Biyoloji ve Hücresel Görüntüleme için NIH CORE hibesi) tarafından desteklenmiştir. Araştırmamız ayrıca NEI Vision Science Pre-doctoree programı 5T32EY023202, Presbiteryen Sağlık Vakfı Araştırma Desteği hibesi ve Körlüğü Önlemek Için Araştırma’dan Dean A. McGee Göz Enstitüsü’ne sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

Intravitreal InjectionMouse ModelBacterial EndophthalmitisPathogenesisIntraocular InfectionQuantitationMicroorganismsHost Immune ResponsesGene ExpressionTreatment EffectivenessBiosafety Level TwoB. CereusMicroinjectorOphthalmic MicroscopeAnesthetized MouseReverse Action Forceps

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image