Murine Eksizyonel Yara İyileştirme Modeli ve Histolojik Morfometrik Yara Analizi
Summary
Bu protokol, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaraların nasıl üretileceğin ve yaraların morfometrik analiziçin nasıl izlendiğini, hasat edilip hazırlanacağını açıklar. Morfometrik kusurları tanımlamak, tam olarak ölçmek ve tespit etmek için seri histolojik bölümlerin nasıl kullanılacağına iliş bir açıklama dahildir.
Abstract
Murine eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin ardışık olarak örtüşen evrelerinin her birini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır: inflamasyon, proliferasyon ve remodeling. Mürin yaraları, iyileşme sürecinin bu farklı evrelerinin ölçülebilir olduğu histolojik olarak iyi tanımlanmış ve kolayca tanınabilir bir yara yatağına sahiptir. Alan içinde histolojik analizler için yaranın keyfi olarak tanımlanmış bir “orta” kullanmak yaygındır. Ancak, yaralar üç boyutlu bir varlıktır ve genellikle histolojik olarak simetrik değildir, küçük bir etki boyutuile morfometrik kusurları tespit etmek için iyi tanımlanmış ve sağlam bir nicel yöntem ihtiyacını destekler. Bu protokolde, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaralar oluşturma prosedürünün yanı sıra belirli seri bölümlerde bir görüntü işleme programı kullanılarak morfometrik parametrelerin nasıl ölçülmeye cerenebilir ayrıntılı bir talimatı açıklanmıştır. Yara uzunluğu, epidermal uzunluk, epidermal alan ve yara alanının iki boyutlu ölçümleri, yarayı kaplayan üç boyutlu epidermal alanı, genel yara alanı, epidermal hacim ve yara hacmini tahmin etmek için kesitler arasındaki bilinen uzaklıkla birlikte kullanılır. Bu ayrıntılı histolojik analiz konvansiyonel analizlere göre daha fazla zaman ve kaynak tüketen olmasına rağmen, titizliği doğal olarak karmaşık bir yara iyileşme sürecinde yeni fenotipleri tespit etme olasılığını artırır.
Introduction
Kutanöz yara iyileşmesi sırayla örtüşen aşamaları ile karmaşık bir biyolojik süreçtir. Hasarlı epitelin bariyer işlevini geri getirmek için zamansal ve mekansal olarak düzenlenmiş hücresel ve moleküler süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. İlk aşamada, inflamasyon, nötrofiller ve makrofajlar yaraya göç, lokal ve sistemik savunma seferber1. İnflamatuar evrenin takibi ve üst üste bindirilen proliferasyon aşamasıdır. Fibroblastlar hızla çoğalmaya ve granülasyon dokusuna göç etmeye başlar. Önden uzak keratinositler, öndeki kenardaki farklılaştırılmış keratinositler yarayı yeniden epitelize etmek için göç ederken yaraya doğru çoğalır2. Son olarak, remodeling ve olgunlaşma aşaması başlar, granülasyon dokusunda fibroblastlar sentez ve mevduat kollajen başlar sırasında. Yeni matrisin yeniden biçimlendirilmesi ve düzenlenmesi yaralanmadan sonra 1 yıla kadar sürebilir3. Birden fazla hücre tipi arasında çapraz konuşma içeren örtüşen olayların karmaşıklığı nedeniyle, ve araştırma yıl rağmen, hücresel ve moleküler mekanizmaların altta yatan yara iyileşmesi nin altında yatan kötü anlaşılmış kalır.
Fare modeli kullanım kolaylığı nedeniyle yara iyileşme mekanizmaları araştırmak için baskın memeli modelidir, nispeten düşük maliyetli ve genetik manipulability1,4,5. Murine modelinde farklı tiplerde yara tanımlanmış olsa da, en sık görülen eksizyonel yaradır (ya bilateral punch ya da direkt punch biyopsisi), ardından kesi yara modelleri4. Eksizyonel yara modeli, doğal olarak iyileşme sürecinden geçmiş olan kontrol dokusunu ürettiği için kesi modeline göre belirgin bir avantaja sahiptir. Cerrahi protokol kapsamında eksizlenen punch biyopsi dokusu, yaralı doku ile aynı şekilde işlenebilir ve istenilen kriter için homeostatik koşulların oluşturulmasında kullanılabilir. Eksizlü kontrol dokusu da bir cilt ön tedavi etkilerini değerlendirmek veya yaralanma sırasında başarılı gen değişikliği teyit yararlı olabilir4.
İyileştirme parametreleri planimetri veya histoloji de dahil olmak üzere birçok farklı teknikle değerlendirilebilir. Ancak, planimetri sadece yaranın görünür özelliklerini değerlendirebilir, ve bir yara varlığı nedeniyle, genellikle histoloji tarafından görselleştirilmiş şifa ölçümleri ile ilişkili değildir, bu nedenle histoloji analiz “altın standart” yapma4. Histolojik analiz altın standart olmasına rağmen, en sık yara nın keyfi bir alt kümesi üzerinde yapılır6,7. Örneğin, yarayı gömmeden ve kesmeden önce yarayı “yarıya” kesmek, malzeme ve veri analizi için harcanan zamanı ve kaynakları azaltmak için şu anda yaygın bir uygulamadır. Bu protokolde tanımlanan morfometrik analiz yöntemi, yara dokusunun tamamını kapsayacak, yaranın morfolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtacak ve küçük bir etki boyutunda yara iyileştirici kusurlarıtespit etme olasılığını artırmak için geliştirilmiştir. Bu protokolde, en sık çalışılan murine yarasını, bilateral tam kalınlıktaki eksizyonel yarayı oluşturmak için cerrahi bir yöntemin yanı sıra histolojik analiz için detaylı ve titiz bir yöntem insa edilen bu tür alanlarda nadiren kullanılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İki taraflı eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin birçok farklı yönünü incelemek için kullanılabilecek son derece özelleştirilebilir bir işlemdir. Bir yara iyileştirme projesi başlamadan önce, araştırmacılar belirli bir etki boyutu nda bir kusur tespit etmek için gerekli yaraların sayısını belirlemek için bir güç analizi yapmak gerekir. Literatürde tek tek farelerin veya yaraların biyolojik kopya olarak kullanılıp kullanılmadığı konusunda tutarsızlıklar mevcut, ancak yeni yapıla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dunnwald Laboratuarı’nın yıllar boyunca bu protokolün optimizasyonuna katkıda bulunan tüm üyelerine ve yara analizi için seri kesit kullanımını teşvik etmedeki ısrarı yaratılmasını mümkün kılan Gina Schatteman’a minnettarız. Bu çalışma NIH/NIAMS’tan Martine Dunnwald’a (AR067739) yapılan fonla desteklenmiştir.
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
Riferimenti
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
