Summary

מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

Published: September 01, 2020
doi:

Summary

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים היא טכניקה מתפתחת לאפיון מבני של חלבונים. תוספי ממס שונים ליגנדים יש תכונות שונות הידרוקסיל רדיקלי ים. כדי להשוות את מבנה החלבון בתנאים שונים, פיצוי בזמן אמת של רדיקלים הידרוקסיל שנוצר בתגובה נדרש כדי לנרמל את תנאי התגובה.

Abstract

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) היא טכניקת ביולוגיה מבנית מבוססת ספקטרומטריה מסה הבדיקה את שטח פני השטח נגיש ממס של חלבונים. טכניקה זו מסתמכת על התגובה של שרשראות צד חומצת אמינו עם רדיקלים hydroxyl מפזר בחופשיות בתמיסה. FPOP מייצר רדיקלים אלה ב situ על ידי פוטו-ליזה לייזר של מי חמצן, יצירת פרץ של רדיקלים הידרוקסיל כי הוא מרוקן על סדר של microsecond. כאשר רדיקלים הידרוקסיל אלה מגיבים עם שרשרת צד חומצת אמינו נגישה ממס, מוצרי התגובה להפגין שינוי המוני שניתן למדוד וכמת על ידי ספקטרומטריית מסה. מאחר שקצב התגובה של חומצת אמינו תלוי בחלקו במשטח הנגיש הממוצע של חומצת אמינו זו, שינויים מדודים בכמות החמצון של אזור נתון של חלבון יכולים להיות קשורים ישירות לשינויים בנגישות ממס של אזור זה בין קונפורמציות שונות (למשל, ליגנד-bound לעומת ליגנד חינם, מונומר לעומת צבירה, וכו ‘) FPOP הוחל במספר בעיות בביולוגיה, כולל אינטראקציות חלבון-חלבון, שינויים קונפורמציה חלבון, וכריכת חלבון ליגנד. כמו הריכוז הזמין של רדיקלים הידרוקסיל משתנה בהתאם לתנאים ניסיוניים רבים בניסוי FPOP, חשוב לפקח על המינון הרדיקלי היעיל אליו אנליטיט החלבון נחשף. ניטור זה מושגת ביעילות על ידי שילוב dosimeter מוטבע כדי למדוד את האות מתגובת FPOP, עם fluence לייזר מותאם בזמן אמת כדי להשיג את הכמות הרצויה של חמצון. עם פיצוי זה, ניתן לקבוע שינויים בטופוגרפיה של חלבונים המשקפים שינויים קונפורמיים, משטחים מחייבים ליגנד ו/או ממשקי אינטראקציה חלבון-חלבון ניתן לקבוע בדגימות הטרוגניות באמצעות כמויות מדגם נמוכות יחסית.

Introduction

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) היא טכניקה מתפתחת לקביעת שינויים טופוגרפיים חלבון על ידי שינוי קוולנטי אולטרה מהיר של שטח הפנים חשוף ממס של חלבונים ואחריו זיהוי על ידי LC-MS1. FPOP מייצר ריכוז גבוה של רדיקלים הידרוקסיל ב situ על ידי לייזר UV פלאש פוטוליזה של מי חמצן. רדיקלים הידרוקסיל אלה הם מאוד תגובתיים וקצרים, נצרך בערך ציר זמן microsecond בתנאים FPOP2. רדיקלים הידרוקסיל אלה לפזר דרך מים וחמצון רכיבים אורגניים שונים בתמיסה בקצבים קינטיים בדרך כלל החל מהיר (~10 6 M-1 s-1)כדי דיפוזיהמבוקרת 3. כאשר הרדיקלי הידרוקסיל נתקל משטח חלבון, הרדיקלי יהיה חמצון שרשראות צד חומצת אמינו על פני השטח של החלבון, וכתוצאה מכך שינוי המוני של חומצת אמינו (בדרך כלל תוספת נטו של אטום חמצן אחד)4. קצב תגובת החמצון בכל חומצת אמינו תלוי בשני גורמים: תגובתיות הטבועה של חומצת אמינו זו (התלויה בשרשרת הצדדית ובהקשר הרצף)4,,5, ונגישות השרשרת הצדדית לרדיקל הידרוקסיל המפזר, המתאם באופן הדוק לאזור הממסהממוצע הנגיש 6,,7. כל חומצות אמינו סטנדרטיות למעט גליצין נצפו כפי שכותרתו על ידי רדיקלים הידרוקסיל תגובתיים מאוד אלה בניסויי FPOP, אם כי בתשואות שונות באופן נרחב; בפועל, סר, ת’ר, אסן ועלא נתפסים לעתים נדירות כחמצון ברוב הדגימות למעט במינונים קיצוניים גבוהים ומזדהים על ידי פיצול ETD ממוקד זהירורגיש 8,9. לאחר חמצון, דגימות מרווה כדי להסיר מי חמצן וחמצון משני (superoxide, חמצן singlet, הידרופרוקסיד פפטידיל, וכו ‘) הדגימות המיוות מתעכלות לאחר מכן כדי ליצור תערובות של פפטידים מחומצנים, כאשר המידע המבני מוקפא כ”תצלום בזק” כימי בתבניות של מוצרי חמצון של הפפטידיםהשונים (איור 1). כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריה מסה (LC-MS) משמש כדי למדוד את כמות חמצון של חומצות אמינו בפפטיד פרוטאוליטי נתון בהתבסס על העוצמות היחסיות של גירסאות מחומצנות ולא חמצון של פפטיד זה. על ידי השוואת טביעת הרגל החמצונית של אותו חלבון המתקבל בתנאים קונפורמיים שונים (למשל, ליגנד-bound לעומת ליגנד חינם), הבדלים בכמות החמצון של אזור נתון של החלבון יכול להיות מתואם ישירות עם הבדלים באזור פני השטח נגיש ממס שלאזור זה 6,7. היכולת לספק מידע טופוגרפי חלבון הופך FPOP טכנולוגיה אטרקטיבית לקביעת מבנה בסדר גבוה יותר של חלבונים, כולל גילוי טיפוליחלבון ופיתוח 10,11.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על FPOP. פני השטח של החלבון משתנים באופן קוולנטי על ידי רדיקלים הידרוקסיל תגובתיים מאוד. הרדיקלים הידרוקסיל יגיבו עם שרשראות צד חומצת אמינו של החלבון בקצב כי הוא מושפע מאוד על ידי הנגישות ממס של השרשרת הצדדית. שינויים טופוגרפיים (לדוגמה, בשל הכריכה של ליגנד כפי שהראה לעיל) יגנו על חומצות אמינו באזור של אינטראקציה מתן תגובה עם רדיקלים הידרוקסיל, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמה של פפטיד שונה באות LC-MS. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

מרכיבים שונים הנוכחים בתמיסת FPOP (למשל, ליגנדים, excipients, מאגרים) יש פעילות טיהור שונה כלפי רדיקלים hydroxyl שנוצר על פוטו-ליזה לייזר של מיחמצן 3. באופן דומה, שינוי קטן בריכוז מי חמצן, פלור לייזר, והרכב מאגר עשוי לשנות את המינון הרדיקלי היעיל, מה שהופך את הרבייה של נתוני FPOP מאתגר על פני הדגימות ובין מעבדות שונות. לכן, חשוב להיות מסוגל להשוות את המינון הרדיקלי hydroxyl זמין להגיב עם חלבון בכל מדגם באמצעות אחד מכמה dosimeters רדיקליהידרוקסיל זמין 12,,13,,14,,15,16. הידרוקסיל רדיקל dosimeters לפעול על ידי מתחרה עם analyte (ועם כל אוכלי הנבלות בתמיסה) עבור הבריכה של רדיקלים הידרוקסיל; המינון היעיל של רדיקלים הידרוקסיל נמדד על ידי מדידת כמות חמצון של הדוסימטר. שים לב כי “מינון רדיקלי הידרוקסיל יעיל” היא פונקציה של הריכוז הראשוני של הידרוקסיל רדיקלי שנוצר ואת מחצית החיים של הרדיקלי. שני פרמטרים אלה תלויים זה בזה חלקית, מה שהופך את המודל הקינטי התיאורטי למורכב במקצת(איור 2). שתי דגימות יכול להיות שונה בפראות רדיקלי ים מחצית חיים תוך שמירה על אותו מינון רדיקלי יעיל על ידי שינוי הריכוז הראשוני של הידרוקסיל רדיקלי נוצר; הם עדיין ייצרו עקבות זהות17. Adenine13 ו Tris12 הם נוח הידרוקסיל רדיקלי dosimeters כי רמת חמצון שלהם ניתן למדוד על ידי ספקטרוסקופיה UV בזמן אמת, המאפשר לחוקרים לזהות במהירות כאשר יש בעיה עם מינון רדיקלי הידרוקסיל יעיל כדי לפתור את הבעיה שלהם. כדי לפתור בעיה זו, dosimeter מוטבע הממוקם במערכת הזרימה מיד לאחר האתר של הקרן שיכול לפקח על האות משינויים בספיגת אדנין בזמן אמת חשוב. זה עוזר בביצוע ניסויים FPOP במאגרים או כל excipient אחר עם רמות שונות באופן נרחב של הידרוקסיל רדיקלי קיבולתניבים 17. פיצוי מינון רדיקלי זה יכול להתבצע בזמן אמת, מניב תוצאות סטטיסטיות לא שונות עבור אותו conformer על ידי התאמת המינון הרדיקלי היעיל.

בפרוטוקול זה, יש לנו הליכים מפורטים לביצוע ניסוי FPOP טיפוסי עם פיצוי מינון רדיקלי באמצעות אדנין כמו מינון רדיקלי אופטי פנימי. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשוות עקבות בין תנאי FPOP בעלי יכולת נקה שונה על-ידי ביצוע פיצוי בזמן אמת.

Figure 2
איור 2: סימולציה קינטית של פיצוי מבוסס ניסיון. 1 mM אדנין דוסימטר תגובה נמדדת 5 μM ליזוזים analyte עם 1 mM ריכוז רדיקלי הידרוקסיל ראשוני (▪OH t1/2=53 ns), ולהגדיר כתגובה דוסימטר היעד (שחור). עם תוספת של 1 מ”מ של היסטדין אוכלי נבלות, תגובת הדוסימטר (כחול) פוחתת יחד עם כמות חמצון חלבון באופן פרופורציונלי (ציאן). גם מחצית החיים של הרדיקלי הידרוקסיל פוחתת (▪OH t1/2=39 ns). כאשר כמות הידרוקסיל רדיקלי שנוצר גדל כדי לתת תשואה שווה ערך של דוזימטר מחומצן בדגימה עם 1 mM היסטידין אוכל נבלות כפי שהושג עם 1 mM הידרוקסיל רדיקלי בהיעדר s נבלות (אדום), כמות חמצון חלבון המתרחשת באופן דומה הופך זהה (מג’טנטה), בעוד המחצית חיים רדיקלי hydroxyl פוחתת עוד יותר (▪OH t1/2=29 ns). מותאם באישור שארפ J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

1. להכין את הספסל האופטי ואת נערך עבור FPOP התראה: לייזרים של KrF excimer הם סכנות עיניים קיצוניות, ואור ישיר או משתקף עלול לגרום לנזק בלתי הפיך לעיניים. תלבש תמיד הגנת עיניים מתאימה, הימנע מנוכחות של עצמים מחזירי אור ליד נתיב הקרן במידת האפשר, והשתמש בבקרות הנדסיות כדי למנוע גישה בלת?…

Representative Results

השוואה של טביעת הרגל פפטיד שרשרת כבדה של adalimumab biosimilar במאגר פוספט וכאשר מחומם ב 55 ° C עבור 1 h להראות תוצאות מעניינות. מבחן t של התלמיד משמש לזיהוי פפטידים שהשתנו באופן משמעותי בשני תנאים אלה (p ≤ 0.05). הפפטידים 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413, ו 414-420 מראים הגנה משמעותית מפני ממס כאשר החלבון מחומם לאצ?…

Discussion

טכניקות מבניות מבוססות ספקטרומטריה מסה, כולל החלפת מימן-דיטריום, קישור צולב כימי, תיוג קוולנטי, ספקטרומטריה מסה ספריי מקורית וניידות יון גדלו במהירות בפופולריות בשל הגמישות שלהם, רגישות, והיכולת להתמודד עם תערובות מורכבות. FPOP מתגאה במספר יתרונות שהגבירו את הפופולריות שלה בתחום של טכניקו?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים מימון מחקר מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים להעניק R43GM125420-01 כדי לתמוך בפיתוח מסחרי של התקן FPOP ספסל ו R01GM127267 לפיתוח פרוטוקולי סטנדרטיזציה וdsimetry עבור FPOP אנרגיה גבוהה.

Materials

Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

Riferimenti

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Biochimica. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochimica. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Biochimica. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Play Video

Citazione di questo articolo
Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

View Video