Анализ естественного метаболизма клеток-убийц человека

Природные клетки Killer (NK) являются врожденными лимфоцитами, которые являются посредниками противоопухоленных и противовирусных реакций. НК-клетки составляют 5-15% всех лимфоцитов в периферической крови человека, а также могут быть найдены в селезенке, печени, костном мозге и лимфатических узлах. НК-клетки не выражают полиморфные клонотичные рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы (TCR) или B-клеточные рецепторы (BCR). В отличие от этого, активация их цитолитических функций вызвана вовлечением рецепторов, которые распознают неизменные лиганды на поверхности^{целевой клетки 1,,2.}

Отдыхающие клетки НК человека, изолированные от периферической крови, могут прожить несколько дней в культурной среде, дополненной сывороткой человека. Активация НК-клеток цитокинами, такими как IL-15 или IL-2, приводит клетки к пролиферации и увеличению их способности убивать,^{среди прочих эффектов 3,,4,,5.} Несколько исследований показали прямую корреляцию между активацией НК-клеток и изменениями в их метаболической^{активности 6.} Эти метаболические изменения предназначены для удовлетворения конкретных потребностей клеток с точки зрения энергии и биосинтеза.

Аэробные клетки и организмы получают энергию через ряд химических реакций, которые включают катаболизм и окисление углеводов, жиров и белков. Благодаря сочетанию гликолиза, трикарбоксиновой кислоты (TCA) цикла и окислительного фосфорилирования, эукариотические клетки отвечают большинству их спроса АТФ и получить промежуточные необходимые в качестве строительных блоков для макромолекул, необходимых для роста клеток и распространения. Процесс гликолиза(рисунок 1A) начинается с ввода глюкозы в клетку. В цитозоле глюкоза фосфорилируется и преобразуется в пируват (с чистым производством 2 молекул АТФ на молекулу глюкозы), которые могут быть сведены к лактату или транспортированы в митохондрии, чтобы быть преобразованы в Ацетил-КоА и войти в цикл TCA. Цикл TCA продолжает езда на велосипеде подпитывается больше молекул Ацетил-КоА и производит CO 2 (что_{в конечном итоге будет} распространяться за пределами клетки и, реагируя с H₂O в среде, будет генерировать углеродную кислоту, которая приведет к подкислению среды) и NADH, молекула отвечает за пожертвование электронов в электронной транспортной цепи (ETC). Электроны проходят через различные белковые комплексы и, наконец, принимаются кислородом. Эти комплексы (I, III и IV) также перекачивают H^– из митохондриальной матрицы в пространство с интермембрана. В результате генерируемого электрохимического⁺ градиента, H- снова войдет в матрицу через комплекс V (ATP-синтазы), инвестируя потенциальную энергию, накопленную в генерацию АТФ.

Как гликолиз, так и митохондриальное дыхание могут быть заблокированы в разных точках с помощью ингибиторов. Знание и использование этих ингибиторов было основой для развития внеклеточного анализа потока. Измеряя два простых параметра в режиме реального времени, таких как рН и кислород, экстраклеточный анализатор потока делает вывод о скорости гликолиза и митохондриального дыхания в 96-хорошо пластины. Стресс-тест на гликолиз проводится в базальной среде без глюкозы(рисунок 1B)⁷. Первые измерения уровня внеклеточного подкисления (ECAR) свидетельствуют о гликолиз-независимом подкислению. Он называется негликолитической подкисления и коррелирует с CO₂ производства TCA, что, как уже объяснялось ранее, сочетается с H₂O в среде для^{генерации} H q (TCA-связанных ECAR). Первая инъекция глюкозы, чтобы вызвать использование глюкозы и повысить гликолиз. Вторая инъекция сочетает в себе как ротенон, ингибитор комплекса I, так и антимицин А, ингибитор комплекса III вместе, чтобы блокировать ETC. Клетки реагируют на это резкое снижение производства митохондриального АТФ путем активации гликолиза для поддержания клеточного уровня АТФ, и это представляет собой количество гликолиза, который не используется клеткой в базальном состоянии, но потенциально может быть завербован в ответ на увеличение спроса на АТФ. Третьей инъекцией является аналог глюкозы 2-Deoxyglucose (DG), который конкурирует с глюкозой в качестве субстрата для фермента гексокиназы. Продукт этого фосфорилирования, 2-дезиглиглукозы-6-фосфат не может быть преобразован в пируват, и поэтому гликолиз блокируется, что снижает ECAR до минимума. ECAR измеряется на данный момент включает в себя другие источники внеклеточного подкисления, которые не связаны с гликолизом или дыхательной деятельности, а также любой остаточный гликолиз не полностью ингибируется 2-DG (пост 2-DG-подкисления).

Митохондриальный стресс-тест проводится в среде с глюкозой(рисунок 1C)⁸. Первые измерения скорости потребления кислорода (OCR) соответствуют базовой линии митохондриального дыхания (базального дыхания). Первая инъекция олигомицин, который препятствует возвращению протонов через синтазу АТФ (комплекс V), блокируя синтез АТФ и тем самым быстро гиперполяризирует митохондриальную мембрану, что предотвращает дальнейшую прокачку протонов через дыхательные комплексы, и приводит к снижению OCR. Сравнение базового дыхания и значения, данное добавлением олигомицина, представляет собой дыхание, связанное с АТФ. Оставшаяся олигомицин-нечувствительная скорость потребления кислорода называется протонной утечкой, которая представляет поток протонов через липидный билейзер или белки во внутренней митохондриальной мембране, такие как адениновым нуклеотидным^{транзислойдом 9.} Вторая инъекция является uncoupler 2,4-динитрофенол (DNP), ионофотор, который вызывает массовое вступление^H в митохондриальной матрицы, что приводит к деполяризации митохондриальной мембраны и нарушение митохондриального синтеза АТФ. Клетки реагируют на рассеивание протонно-мотивной силы, увеличивая скорость транспортировки электронов и потребления кислорода до максимального уровня в тщетной попытке восстановить мембранный потенциал (максимальная дыхательная способность). Разница между максимальной дыхательной способности и базального дыхания запасных дыхательной способности клетки, которая представляет собой количество дыхания, которое не используется клеткой для создания АТФ в базальной состоянии, но потенциально может быть набран в ответ на увеличение спроса АТФ или в^{условиях стресса 8}. Третья инъекция представляет собой сочетание ротенона и антимицина А. Эта инъекция полностью останавливает ETC и OCR уменьшается до самого низкого уровня, при этом оставшееся потребление кислорода не митохондриальное (вызванное NADPH-оксидами и т.д.).

Изменения в метаболических путей может каким-то образом предсказать функционирование НК-клеток, как было высказано предположение, что непрерывная активация НК-клеток с цитокинами в пробирке может привести к истощению НК клеток путем изучения различных метаболических^{путей 10,11}. Корреляция между метаболическим статусом и функцией НК-клеток очень важна с точки зрения иммунотерапии рака. В этой области, активация НК-клеток с вливанием IL-15, в одиночку или в сочетании с моноклональными терапевтическими антителами были протестированы для того, чтобы улучшить опухолевые^{клетки убийство 12,13,14}. Знание метаболического статуса НК-клеток в ответ на эти стратегии лечения обеспечит ценный предиктор статуса активации нк-клеток и функции убийства.

Изучение метаболических путей в других миелоидных и лимфоидных клеток, таких как моноциты, Т и В^{клетки были описаны 15} и оптимизированные методы были^{опубликованы 16}. В этом протоколе мы предоставляем метод, который сочетает в себе как протокол изоляции НК, который дает большое количество чистых и жизнеспособных НК-клеток, так и оптимизированный протокол для измерения метаболической активности с помощью внеклеточного анализатора потока. Здесь мы показываем, что это действительный метод для изучения метаболических изменений в отдыха и IL-15 активированных клеток человека НК. Для анализа внеклеточного потока были протестированы и оптимизированы такие параметры, как количество клеток и концентрации наркотиков. По сравнению с другими респирометрическими методами, экстраклеточный анализатор потока полностью автоматизирован и способен тестировать в режиме реального времени, с очень низким количеством клеток, до 92 образцов одновременно, и, таким образом, позволяет высокую пропускную способность скринингов (с несколькими образцами и репликациями)^{в относительно быстром порядке 17}.

Этот метод может быть использован исследователями, заинтересованными в оценке функции НК-клеток путем изучения метаболизма НК-клеток. Он может быть применен также к клеткам, активированным другими цитокинами, антителами или растворимыми стимулами.