Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes
Summary
Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.
Abstract
Les microglies résident les cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC). Les microglies jouent un rôle essentiel pendant le développement, dans le maintien de l’homéostasie, et pendant l’infection ou les blessures. Plusieurs groupes de recherche indépendants ont mis en évidence le rôle central que jouent les microglies dans les maladies auto-immunes, les syndromes autoinflammatoires et les cancers. L’activation de la microglie dans certaines maladies neurologiques peut participer directement aux processus pathogènes. Les microglies primaires sont un outil puissant pour comprendre les réponses immunitaires dans le cerveau, les interactions cellule-cellule et les phénotypes dysrégulés de microglie dans la maladie. Les microglies primaires imitent mieux les propriétés microgliales in vivo que les lignées cellulaires microgliales immortalisées. Les microglies adultes humains présentent des propriétés distinctes par rapport aux microglies foetales et rongeurs humaines. Ce protocole fournit une méthode efficace pour l’isolement des microglies primaires du cerveau humain adulte. L’étude de ces microglies peut fournir des informations critiques sur les interactions cellule-cellule entre les microglies et d’autres populations cellulaires résidentes dans le SNC, y compris les oligodendrocytes, les neurones et les astrocytes. En outre, les microglies de différents cerveaux humains peuvent être cultivées pour la caractérisation des réponses immunitaires uniques pour la médecine personnalisée et une myriade d’applications thérapeutiques.
Introduction
Le système nerveux central (SNC) est construit à partir d’un réseau complexe de neurones et de cellules gliales1. Parmi les cellules gliales, les microglies fonctionnent comme les cellules immunitaires innées du SNC2,3. Les microglies sont responsables du maintien de l’homéostasie dans le SNC4en bonne santé . Les microglies jouent également un rôle important dans le neurodéveloppement, en élaguant les synapses2. Les microglies sont au cœur de la pathophysiologie de plusieurs maladies neurologiques, y compris, mais pas limitée à; Maladie d’Alzheimer5, maladie de Parkinson6, ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL7, Sclérose en plaques8, lésion cérébrale traumatique9, douleur neuropathique10, lésions de la moelle épinière11 et tumeurs cérébrales telles que les gliomes12.
Les études liées à l’homéostasie et aux maladies du SNC utilisent des microglies de rongeurs en raison d’une pénurie de protocoles d’isolement des microglies primaires humaines efficaces et rentables13. Les microglies de rongeurs ressemblent à des microglies humaines primaires dans l’expression de gènes tels que Iba-1, PU.1, DAP12 et M-CSF récepteur et ont été efficaces dans la compréhension normale ainsi que le cerveau malade13. Fait intéressant, l’expression de plusieurs gènes immunitaires connexes tels que TLR4, MHC II, Siglec-11 et Siglec-3 varie entre les microglies humaines et les rongeurs13. L’expression de plusieurs gènes varie également dans l’expression temporelle et dans les maladies neurodégénératives chez les deux espèces14,15. Ces différences significatives font de la microglie humaine un modèle essentiel pour étudier la fonction de microglie dans l’homéostasie et la maladie. La microglie humaine primaire peut également être un outil efficace pour le dépistage préclinique des candidats potentiels16. Les raisons mentionnées ci-dessus soulignent le besoin croissant de protocoles rentables pour l’isolement des microglies humaines primaires.
Nous avons développé un protocole pour l’isolement de la microglie humaine primaire du tissu humain adulte de cerveau recueilli à la suite de la fenêtre chirurgicale créée pour les résections de tumeur ou d’autres résections chirurgicales. La méthode ici est considérablement différente des méthodes existantes. Nous avons pu isoler et culturer des microglies après un temps de transit d’environ 75 minutes entre le site de collecte des tissus et le début du protocole d’isolement en laboratoire. Nous avons utilisé le supernatant des cellules fibroblastiques L929 pour favoriser la croissance de microglies isolées. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la culture et le développement de microglies primaires seulement. La culture qui en résulte est d’environ 80% de microglies. Alors que d’autres protocoles fournissent une culture enrichie de microglies par centrifugation gradient de densité, cytométrie de flux et perles magnétiques, le protocole est un moyen rapide, simple, robuste et rentable à la culture primaire microglie humaine17,18,19,20. La capacité d’utiliser le tissu cérébral adulte vivant enlevé chirurgicalement au lieu des tissus fixes du cerveau des cadavres prouve un avantage supplémentaire de cette méthode contrairement aux procédures existantes18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglie assurer l’homéostasie dans le cerveau normal et jouer un rôle central dans la pathophysiologie de diverses maladies neurologiques4. Les microglies sont au cœur du neurodéveloppement et de la formation des synapses2. Les études microgliale se sont avérées essentielles dans la compréhension du développement et de la progression de diverses maladies neurologiques4. Les microglies de rongeurs sont le modèle de choix prédominant pou…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le laboratoire de SJ a été créé grâce à des subventions institutionnelles de l’IITJ et est financé par des subventions du Département de la biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) et du Ministère de l’électronique et des technologies de l’information du Gouvernement de l’Inde (no 4(16)/2019-ITEA). Les sections de tissu cérébral humain ont été obtenues du All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur après l’autorisation du comité d’éthique institutionnel. Nous remercions Mayank Rathor, B.Tech Student membre de design and Arts Society IIT Jodhpur, pour son soutien en vidéographie.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
