Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att studera neuronal α-synuclein ackumulering i primära mus dopamin nervceller. Fosforylerade α-synucleinaggregat i nervceller induceras med förformade α-synuclein fibriller. Automatiserad avbildning av immunofluorescently märkta celler och opartisk bildanalys gör detta robusta protokoll lämpligt för medelhög till hög genomströmning screening av läkemedel som hämmar α-synuclein ackumulering.
Målet med detta protokoll är att upprätta en robust och reproducerbar modell av α-synuclein ackumulering i primära dopamin nervceller. Kombinerat med immunstainning och opartisk automatiserad bildanalys möjliggör denna modell analys av effekterna av läkemedel och genetiska manipulationer på α-synucleinaggregation i neuronala kulturer. Primära midbrain kulturer ger en tillförlitlig källa till bona fide embryonala dopamin nervceller. I detta protokoll, kännetecknet histopathology av Parkinsons sjukdom, Lewy organ (LB), härmades genom tillägg av α-synuclein preformade fibriller (PFFs) direkt till neuronal kultur media. Ackumulering av endogena fosforylerade α-synuclein i soma av dopamin nervceller detekteras av immunstainning redan på 7 dagar efter PFF tillägg. In vitro-cellodlingsförhållanden är också lämpliga för tillämpning och utvärdering av behandlingar som förhindrar α-synukleinackumulering, såsom små molekylläkemedel och neurotrofa faktorer, samt lentivirusvektorer för genetisk manipulation (t.ex. med CRISPR/Cas9). Odling av nervceller i 96 brunnsplattor ökar robustheten och kraften i de experimentella uppställningarna. I slutet av experimentet är cellerna fixerade med paraformaldehyd för immunocytokemi och fluorescensmikroskopiavbildning. Multispektrala fluorescensbilder erhålls via automatiserad mikroskopi av 96 brunnsplattor. Dessa data kvantifieras (t.ex. räkna antalet fosfo-α-synuclein-innehållande dopamin nervceller per brunn) med hjälp av fri programvara som ger en plattform för opartisk höginnehåll fenotyp analys. PFF-inducerad modellering av fosforylerade α-synuclein ackumulering i primära dopamin nervceller ger ett tillförlitligt verktyg för att studera de underliggande mekanismerna medla bildning och eliminering av α-synuclein inneslutningar, med möjlighet till hög genomströmning drog screening och cellulära fenotyp analys.
Parkinsons sjukdom (PD) är en neurodegenerativ sjukdom som kännetecknas av död midbrain dopamin nervceller i substantia nigra (SN), efterföljande förlust av dopamin tonen i basala ganglier, och därav följande motoriska nedskrivningar1,2. En stor histopatologiska funktionen i hjärnan hos PD-patienter är intracellulära protein /lipidaggregat som finns i neuronal soma, kallas Lewy organ (LB), eller i neurites, Lewy neurites (LN), kollektivt känd som Lewy patologi3. Lewy patologi i hjärnan verkar utvecklas med framåt PD liknar spridningen av patogena faktorer genom neuronala anslutningar. Riklig Lewy patologi finns i dopamin nervceller i SN och celler i andra områden som påverkas av neurodegeneration4. Men under sjukdomsprogression, spridning och uppkomsten av protein aggregering inte alltid korrelerar med neuronal död och det exakta bidraget av Lewy patologi till neuronal död är fortfarande oklart5.
LB och LN hade visat sig bestå av membranösa och proteinhaltiga komponenter3. De förstnämnda är membranfragment, vesikulära strukturer (eventuellt lysosomer och autofagosomer) och mitokondrierna3. Den senare består av minst 300 olika proteiner6. En hallmark studie av Spillantini et al.7 visade att den viktigaste proteinkomponenten i Lewy patologi är α-synuclein. Starkt uttryckt i nervceller, och i samband med membran fusion och signalsubstans release, α-synuclein i Lewy patologi är närvarande mestadels i felvikta, amyloid fibril form, varav huvuddelen fosforyleras på Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Viktigt, Det visades också att på grund av dess prion-liknande egenskaper, felvikta α-synuclein kan ha en orsakande roll i Lewy patologi bildning4. De prionliknande egenskaperna hos felvikta α-synuclein visades med både midbrainextrakt från patienter och exogent beredda α-synucleinpreformerade fibriller (PFFs) för att inducera α-synucleinaggregat i nervceller i kultur och in vivo9,10. PFFs presenterar en tillförlitlig och robust modell för att studera utvecklingen av α-synuclein patologi i dopamin nervceller. När PFFs tillämpas på odlade primära nervceller eller injiceras i djurhjärnan, de leder till bildandet av α-synuclein-innehållande inneslutningar i neuriter och cell soma11 som rekapitulerar många funktioner sett i Lewy patologi. Observerade inneslutningar är tvättmedelslösliga i Triton X, ubiquitinerade, färgade med amyloid specifika färgämnet Thioflavin S, och innehåller α-synuclein hyperfosforylerade på Ser12911,12. Viktigt, dessa inneslutningar bildas inte i α-synuclein knockout djur11, vilket tyder på beroendet av deras bildning på endogena α-synuclein.
Icke desto mindre är det svårt att direkt jämföra PFF-inducerad inneslutningar och Lewy patologi finns i PD patienter eftersom mänskliga LBs och LNs är mycket heterogena3. Observerade heterogenitet Lewy patologi kan orsakas av olika stadier av bildandet, olika anatomiska plats, eller skillnader i konformation av felvikta α-synuclein initiera aggregering processen. Samma faktorer kan påverka PFF-inducerad pS129-αsyn positiva inneslutningar. I själva verket, nyligen visade det sig att PFF-inducerad pS129-αsyn positiva inneslutningar i primära neuronala kulturer representerar mycket tidiga stadier av patologi som kan mogna till strukturer som liknar LB efter långvarig inkubationstid12,13.
Modellering tidig spridning och ackumulering av felvikta α-synuclein med PFFs är värdefullt för läkemedelsutveckling, som Lewy patologi spridning anses vara en av de tidiga sjukdomsmarkörerna. Därför kan aggregeringsförebyggande behandlingar vara lovande för att stoppa eller bromsa utvecklingen av PD i mycket tidiga skeden. Flera kliniska prövningar som syftar till att bromsa eller stoppa ackumulering av α-synuclein pågår14. För patienter i senare skeden kan transplantation av dopaminneuronala stamfader vara ett bättre behandlingsalternativ15. Lewy patologi dokumenterades dock i transplanterade embryonala nervceller under obduktionen analys av PD patientens hjärnor16,17, också anger behovet av skydd mot α-synuclein ackumulering.
In vitro, α-synuclein PFFs är kända för att inducera aggregering i förevigade cellinjer, eller oftare, i gnagare primära hippocampus eller när nervceller. Ingen av dessa är nära att recapitulating dopamin nervceller10. Odling av dessa nervceller kräver tät plätering av vissa antal nervceller in vitro18. För att uppnå hög plätering densitet med begränsat material (t.ex. primära dopamin nervceller), mikro ön odling metod används ofta. I mikro ö odling, celler är ursprungligen pläterade i en liten droppe medium (vanligtvis några mikroliter) hålls samman av ytspänning i mitten av en stor brunn18. Efter nervceller bifoga, hela brunnen är fylld med mediet medan cellerna förblir begränsade vid hög densitet i det lilla pläteringsområdet. Förutom att uppnå hög plätering densitet, mikro öar också förhindra plätering nära kanterna av brunnar, där variationer i celltäthet och överlevnad är vanliga. Mikroöar används ofta i relativt stora brunnar eller rätter; dock, upprättande midbrain neuronala kulturer i mikro öar i 96 väl platta format möjliggör studiet av Lewy patologi i bona fide dopamin nervceller med medelhög till hög genomströmning makt. In vitro-experiment med dessa nervceller tillät oss att upptäcka den gliacelllinjebaserade neurotrofa faktorn (GDNF), som främjar överlevnaden av mogna dopaminneuronin vitro och in vivo19,20,2121,22 och förhindrar även bildandet av α-synucleinaggregat i dopaminneuron23. Mänskliga patient-inducerad pluripotenta stamceller-härledda dopamin nervceller utgör en mer exakt modell på grund av deras mänskliga ursprung och längre överlevnad tid in vitro. Induktion av α-synucleinpatologi hos mänskliga nervceller observeras dock efter flera månader, jämfört med en vecka i mus embryonala nervceller och/eller med flera stressfaktorer (t.ex. kombination av α-synuclein overexpression och PFFs)24,25. Dessutom, underhåll av mänskliga dopamin nervceller är dyrare och mödosamt jämfört med primära embryonala nervceller, i huvudsak begränsa deras användning i hög genomströmning applikationer.
Vidare kan primära dopaminneuronkulturer modifieras genetiskt (t.ex. med CRISPR/Cas9) och/eller behandlas med farmakologiska medel23. De utgör en snabb och reproducerbar plattform för applikationer som molekylär väg dissekering och drogbibliotek screening. Även om begränsat material kan erhållas från dessa kulturer, är det fortfarande möjligt att genomföra små genomik /proteomics analyser. Odling primära nervceller i 96 väl format är bättre för immunocytochemistry och fluorescensmikroskopi tekniker, följt av hög innehåll fenotyp analys. Multispektrala fluorescensbilder från automatiserad avbildning av 96 brunnsplattor kan omvandlas till kvantitativa resultat (t.ex. antalet LB-innehållande nervceller per brunn). Sådana analyser kan göras med fri programvara, till exempel CellProfiler26,27. Totalt sett, primära embryonala midbrain kulturer pläterade i 96 väl plattor ger en robust och effektiv plattform för att studera dopamin nervceller och α-synuclein aggregering med möjlighet till hög genomströmning fenotyp screening.
Sprida Lewy patologi, varav pS129-αsyn är en viktig beståndsdel, är en histopatologiska kännetecken för PD. Stoppa eller bromsa ansamling av aggregerade pS129-αsyn kan bromsa degeneration av dopamin nervceller och utvecklingen av alfa-synucleinopathy. Emellertid, en mekanistisk förståelse av hur pS129-αsyn aggregering bidrar till nedläggningen av dopamin nervceller fortfarande måste fastställas. Bevis från studier efter människans postmortem på hjärnprover från patienter i olika stadier av sjukdomen samt observation av pS129-αsyn positiv integration i transplanterade fetala nervceller tyder starkt på spridning av Lewy patologi mellan cellerna16,17,33. Prion-liknande spridning av pS129-αsyn har därför nyligen sammanfattats med hjälp av α-synuclein PFFs9,10. Etablera en robust, kostnadseffektiv, och relativt hög- eller medelgenomströmning modell av pS129-αsyn spridning och ackumulering, särskilt i dopamin nervceller, kan avsevärt påskynda sökandet efter nya behandlingar och föreningar ändra denna process.
Eftersom förlust av dopamin nervceller är den främsta orsaken till motoriska symtom i PD och dessa celler har många unika egenskaper2,34,35, modellering av prion-liknande spridning av pS129-αsyn i dopamin nervceller är den mest relevanta typen av modell från translationella perspektiv. Protokoll som använder mikro ö kulturer av embryonala midbrain nervceller på 4 väl plattor och halvautomatisk kvantifiering har beskrivits tidigare18. Det protokoll som beskrivs här anpassades till 96 brunnsplattor och ger mindre mödosam beredning av mikroöar, vilket möjliggör beredning av upp till fyra plattor som innehåller 60 brunnar vardera av en erfaren forskare under en arbetsdag. Culturing dopamin nervceller i 96 väl plattor möjliggör testning läkemedel på lägre mängder och möjliggör hög transduktion priser med lentivirus vektorer. Det är också möjligt att kombinera olika behandlingar för att utföra mer komplexa experiment.
Innan någon behandling (inklusive PFFs) tillämpas bör kvaliteten på odlingen kontrolleras med ljusfältsmikroskopi. Om mikroskopisystemet inte använder en CO2 kammare med uppvärmning, cellerna bör inte hållas utanför inkubatorn i mer än några minuter, eftersom primära mus dopamin nervceller är känsliga och lätt stressade. Av samma skäl rekommenderas att den första bildåtergivningen ska göras efter 24 timmars inkubation (mellan DIV1-DIV3). Cellerna ska verka vara vid liv med nuvarande cellkroppar och homogent spridas inuti mikroön. Primära nervceller skulle ha bosatt sig på PO-belagda marken och började etablera neuronala prognoser. Det är möjligt att observera små klumpar av celler (dvs. diameter mindre än 150–200 μm) som kan bildas om triturationsprocessen inte görs på rätt sätt eller pläteringsdensiteten är högre än rekommenderat. Dessa små klumpar skulle inte påverka experimentet, om de inte är mer än ett fåtal per brunn och / eller större. Klumpiga celler gör det mycket svårt att identifiera immunohistokemiska markörer och enskilda celler under bildanalysen. Det är viktigt att undvika sådana klumpar genom noggrann beläggning, triturating, och kontrollera plätering densitet. Om enhetligheten i dessa villkor inte kan iakttas vid vissa brunnar, inkludera inte dessa defekta brunnar i experimentet. Ett sådant undantag bör göras innan någon behandling utförs.
Dessutom, utnyttjande av 96 väl plattor möjliggör bekväm flerkanalig pipett användning under färgning förfaranden och direkt visualisering med automatisk platta mikroskop, ytterligare öka genomströmningen. Användning av automatiserad bildkvantifiering är oumbärlig för analys av data från högkvalitativa bildplattformar. Förutom förmågan att bearbeta tusentals bilder som erhållits från varje experiment, säkerställer det opartisk, identisk kvantifiering av alla behandlingsgrupper. Det arbetsflöde som föreslås för bildanalysen baseras på enkla principer för segmentering av dopaminneuroner, filtrering av korrekt segmenterade celler genom övervakad maskininlärning och därefter kvantifiering av fenotyper (pS129-αsyn positiv och pS129-αsyn negativ), igen genom övervakad maskininlärning. Även om flera olika metoder för denna uppgift kan föreställa sig, Vi har hittat kombinationen av segmentering med maskininlärning vara den mest robusta för dopamin kulturer på grund av hög plätering densitet, de olika formerna av dopamin nervceller, och förekomsten av starkt färgade neurites. Den föreslagna bildanalysalgoritmen implementerades i CellProfiler och CellProfiler Analyst, öppen källkod, fritt tillgänglig programvara för bildanalys av höginnehåll26,27. Algoritmen kan också implementeras med andra bildanalysprogram, antingen öppen källkod (t.ex. Men enligt vår erfarenhet dessa ofta offra anpassningsmöjligheter för användarvänlighet, och därför kanske inte fungerar bra i komplicerade analyser. Vi har funnit att CellProfiler och CellProfiler Analyst mjukvarupaket ger särskilt tillförlitliga resultat genom att kombinera ett stort antal implementerade algoritmer, extrem flexibilitet i utformningen av arbetsflödet, och samtidigt hantering och effektiv bearbetning av hög innehåll bilddata.
Det beskrivna protokollet kan också anpassas för kvantifiering av andra cellulära fenotyper som kännetecknas av immunsormning med olika antikroppar, såsom markörer för andra neuronala populationer (t.ex. DAT, GAD67, 5-HT etc.) och proteinaggregat (t.ex. fospo-Tau, ubiquitin). Flera fluorescerande markörer kan också kombineras för att skilja flera fenotyper (t.ex. celler med inneslutningar i olika stadier av mognad). Automatiserad klassificering av flera fenotyper bör också vara lätt att genomföra i de beskrivna bildanalyspipelledningarna genom att bara lägga till en kanal som innehåller immunofluorescent bilder av ytterligare markörer för att mäta steg och sortera celler i flera lagerplatser. Användning av flera markörer samtidigt skulle dock kräva optimering av immunstainning och bildframställning villkor. Dessutom, för bättre kvalitet i immunofluorescens imaging, användning av särskilda svartväggiga 96 väl plattor uttryckligen utformade för fluorescerande mikroskop rekommenderas. Dessa kan dock vara betydligt dyrare än vanliga cellodlingsplattor, vilket är tillräckligt för den analys som beskrivs i vårt protokoll.
Typ och kvalitet av utnyttjade PFFs är avgörande för resultatet av experimenten. PIF-fonder kan både påverka analysens robusthet och tolkningen av resultaten. Beredningsförhållanden kan påverka såddeffektiviteten hos pff-fonder och, faktiskt, PFF-“stammar” med olika fysiologiska egenskaper har rapporterats36. Utarbetandet och valideringen av pff:er ligger dock utanför denna artikels tillämpningsområde och har beskrivits i flera publikationer11,,28,,29,30. Utöver beredningsprotokollet bör ursprungsarten för α-synuklein i pff-fibrer (t.ex. mus, människa) och användningen av vildtyp eller muterat protein (t.ex. human a53T α-synuclein) beaktas, beroende på de särskilda experimentella förhållandena. Induktion av pS129-αsyn ackumulering av PFFs visade sig vara beroende av kulturens ålder (dvs. dagar in vitro), med mer mogna kulturer som visar mer uttalad induktion11. Detta beror förmodligen på det ökade antalet neuronala anslutningar i mer mogna kulturer, och ökade α-synuclein proteinnivåer. I våra händer gav behandling med PFFs vid DIV8 de mest robusta resultaten, med uttalad ackumulering av pS129-αsyn i dopamin neuron soma, utan att kompromissa med neuronal överlevnad. Det beskrivna protokollet är väl lämpad att studera behandlingar ändra tidiga händelser som leder till aggregering av endogena α-synuclein eftersom vi kvantifiera pS129-αsyn positiva inneslutningar vid en relativt tidig tidpunkt, 7 dagar efter inokulering med PFFs. Vid denna tidpunkt, intrasomal inneslutningar finns i en betydande del av cellerna och kan lätt särskiljas genom immunstaining medan ingen PFF-inducerad cell död observeras, förenkla tolkningen av resultaten. Viktigt, eftersom morfologi och sammansättning av PFF-inducerad inneslutningar kan förändras över tiden12,13, det beskrivna protokollet kan i princip ändras för att studera mer mogna inneslutningar genom fixering och immunstainning vid senare tidpunkter. Emellertid, hålla dopamin nervceller i kultur längre än 15 dagar kräver extrem försiktighet, och kan framkalla ytterligare variation på grund av celler inte överleva självständigt från PFF inokulering. Dessutom komplicerar mer utökade kulturer läkemedelsbehandlingsscheman. Många föreningar har begränsad eller inte dåligt kännetecknas stabilitet i cellodlingsmediet, och påfyllning av ett läkemedel är inte trivialt eftersom fullständigt utbyte av medium äventyrar överlevnaden av dopaminkulturer.
Fosforylering av α-synuklein vid Ser129 rapporteras konsekvent i PFF-baserade modeller av α-synucleinaggregering och colocalizes med markörer för felvikning och aggregering såsom Thioflavin S, ubiquitin, eller konformationsspecifika antikroppar11,12. I våra händer ger immunvård för pS129-αsyn också den starkaste signalen med den lägsta bakgrunden och är enklaste att analysera, vilket ger robusta resultat när flera behandlingar kontrolleras. Viktigt är att immunstainning med pS129-αsyn-antikroppar inte detekterar PDF:er som förblir utanför cellerna, vilket avsevärt minskar bakgrunden. Det är dock viktigt att komma ihåg att Ser129 fosforylering förmodligen är en av de tidigaste processer som är kopplade till felvikning av α-synuclein och kan regleras annorlunda under särskilda förhållanden. Därför bör alla resultat som visar positiva effekter på pS129-αsyn bekräftas av andra markörer.
Statistisk analys bör skräddarsys på motsvarande sätt med experimentell design. Det är viktigt att utföra experiment i minst tre oberoende biologiska replikat (dvs. separata primära neuronala kulturer). Dessa replikat bör pläteras på olika plattor och behandlas oberoende av dem. Vi analyserar data från replikat på olika plattor med slumpmässig blockdesign ANOVA37 för att ta hänsyn till ihopparning av data för olika experimentella plattor.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar prof. Kelvin Luk för hans generösa gåva av α-synuclein PFFs, Conjung Zheng för att etablera och odling neuronala celler, och Light Microscopy Unit vid Institutet för bioteknik, Helsingfors universitet, för imaging immunfläckade celler. Detta arbete stöddes av bidrag från 3i-Regeneration av Business Finland (Finansieringsverket för innovation), Finlands Akademi #309489, #293392, #319195. Sigrid Juselius Foundation, och de lagstadgade medlen från Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |