Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudiar la acumulación de sinucleína neuronal en las neuronas primarias de dopamina de ratón. Los agregados de sinucleína fosforilada en las neuronas se inducen con fibrillas preformadas de sinucleína. Las imágenes automatizadas de células etiquetadas inmunofluorescentemente y análisis de imágenes imparciales hacen que este protocolo robusto sea adecuado para el cribado de rendimiento medio-alto de fármacos que inhiben la acumulación de sinucleína.
El objetivo de este protocolo es establecer un modelo robusto y reproducible de la acumulación de sinucleína en las neuronas primarias de dopamina. Combinado con la inmunostaining y el análisis automatizado de imágenes imparcial, este modelo permite el análisis de los efectos de los fármacos y manipulaciones genéticas en la agregación de sinucleína en cultivos neuronales. Cultivos primarios de cerebro medio proporcionan una fuente confiable de neuronas de dopamina embrionaria de buena fe. En este protocolo, la histopatología distintiva de la enfermedad de Parkinson, los cuerpos de Lewy (LB), se imita por la adición de fibrillas preformadas de sinucleína (PFF) directamente a los medios de cultivo neuronales. La acumulación de fosforilado endógeno -sinucleína en el soma de las neuronas de dopamina se detecta mediante inmunotenchación ya a los 7 días después de la adición de PFF. Las condiciones de cultivo celular in vitro también son adecuadas para la aplicación y evaluación de tratamientos que impiden la acumulación de sinucleína, como fármacos de moléculas pequeñas y factores neurotróficos, así como vectores de lentivirus para la manipulación genética (por ejemplo, con CRISPR/Cas9). El cultivo de las neuronas en 96 placas de pozo aumenta la robustez y la potencia de las configuraciones experimentales. Al final del experimento, las células se fijan con paraformaldehído para inmunocitoquímica y imágenes de microscopía de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia multiespectral se obtienen mediante microscopía automatizada de 96 placas de pozo. Estos datos se cuantifican (por ejemplo, contando el número de neuronas de dopamina que contienen fosfo- – sinucleína por pozo) con el uso de software libre que proporciona una plataforma para el análisis imparcial de fenotipo de alto contenido. El modelado inducido por PFF de la acumulación de fosforilada -sinucleína en las neuronas primarias de dopamina proporciona una herramienta confiable para estudiar los mecanismos subyacentes que median la formación y eliminación de las inclusiones de sinucleína, con la oportunidad de detección de fármacos de alto rendimiento y análisis de fenotipos celulares.
La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la muerte de las neuronas de dopamina de cerebro medio en la sustancia nigra (SN), posterior pérdida del tono de dopamina en los ganglios basales, y consecuentes deficiencias motoras1,2. Una característica histopatológica importante en el cerebro de los pacientes con DP son los agregados de proteínas/lípidos intracelulares que se encuentran en el soma neuronal, llamados cuerpos de Lewy (LB), o en neuritas, Neuritas de Lewy (LN), conocidas colectivamente como patología lewy3. La patología de Lewy en el cerebro parece progresar con el avance de la DP que se asemeja a la propagación de factores patógenos a través de conexiones neuronales. Abundante patología Lewy se encuentra en las neuronas de dopamina en el SN y células en otras áreas afectadas por la neurodegeneración4. Sin embargo, durante la progresión de la enfermedad, la propagación y la aparición de la agregación de proteínas no siempre se correlacionan con la muerte neuronal y la contribución exacta de la patología de Lewy a la muerte neuronal sigue sin estar clara5.
Se ha demostrado que LB y LN consisten en componentes membranosos y proteicos3. Los primeros son fragmentos de membrana, estructuras vesiculares (posiblemente lisosomas y autofagosomas) y mitocondrias3. Este último consta de al menos 300 proteínas diferentes6. Un estudio distintivo de Spillantini et al.7 demostró que el principal componente proteico de la patología de Lewy es la sinucleína. Muy expresado en las neuronas, y vinculado con la fusión de membrana y la liberación de neurotransmisores, la sinucleína en la patología de Lewy está presente principalmente en forma desdoplete, fibrina amiloide, la mayor parte de la cual se fosforila en Ser129 (pS129-‘syn)4,8.
Es importante destacar que también se demostró que debido a sus propiedades similares a los priones, la sinucleína desdobada podría tener un papel causal en la formación de patología de Lewy4. Las propiedades similares a los priones de la sinucleína con un plegón se mostraron con tanto extractos de cerebro medio de los pacientes como con fibrillas preformadas de sinucleína preparadas exógenamente (PFF) para inducir agregados de sinucleína en las neuronas en el cultivo e in vivo9,,10. Los PFF presentan un modelo fiable y robusto para estudiar la progresión de la patología de la sinucleína en las neuronas de dopamina. Cuando los PFF se aplican a las neuronas primarias cultivadas o se inyectan en el cerebro animal, conducen a la formación de inclusiones que contienen sinucleína en neuritas y soma celular11 que recapitulan muchas características vistas en la patología de Lewy. Las inclusiones observadas son detergente-insolubles en Tritón X, ubiquitinadas, manchadas con el tinte específico amiloide Thioflan S, y contienen -sinucleína hiperfosforilada en Ser12911,12. Es importante destacar que estas inclusiones no se forman en los animales knockout de la sinucleína11, lo que indica la dependencia de su formación en endógenos de la sinucleína.
Sin embargo, es difícil comparar directamente las inclusiones inducidas por PFF y la patología de Lewy que se encuentra en pacientes con DP porque los LB y LN humanos son altamente heterogéneos3. La heterogeneidad observada de la patología de Lewy puede ser causada por diferentes etapas de la formación, diferente ubicación anatómica, o diferencias en la conformación de la sinucleína mal pleida iniciando el proceso de agregación. Los mismos factores podrían influir en las inclusiones positivas de pS129-‘syn inducidas por PFF. De hecho, recientemente se demostró que las inclusiones positivas de pS129-‘syn inducidas por PFF en cultivos neuronales primarios representan etapas muy tempranas de la patología que pueden madurar a estructuras que se asemejan mucho a la LB después del período de incubación prolongado12,,13.
Modelar la propagación temprana y la acumulación de sinucleína con PFF con pfnúngicas es valioso para el desarrollo de fármacos, ya que la propagación de la patología de Lewy se considera uno de los marcadores de la enfermedad en etapa temprana. Por lo tanto, los tratamientos preventivos de agregación pueden ser prometedores para detener o ralentizar la progresión de la DP en etapas muy tempranas. Varios ensayos clínicos destinados a ralentizar o detener la acumulación de sinucleína están en curso14. Para pacientes en etapa posterior, el trasplante de progenitores neuronales de dopamina puede ser una mejor alternativa de tratamiento15. Sin embargo, la patología de Lewy se documentó en neuronas embrionarias trasplantadas durante el análisis post mortem de los cerebros de pacientes con DP16,,17, lo que también indica la necesidad de protección contra la acumulación de sinucleína.
Se sabe que los PFF in vitro de la sinucleína inducen la agregación en líneas celulares inmortalizadas, o más comúnmente, en neuronas corticales o hipocampales primarias de roedores. Ninguno de estos están cerca de recapitular las neuronas de dopamina10. Cultivar estas neuronas requiere un revestimiento denso de cierto número de neuronas in vitro18. Para lograr una alta densidad de chapado con material limitado (por ejemplo, neuronas primarias de dopamina), el método de cultivo de microisla se utiliza comúnmente. En el cultivo de microismís, las células se chapan inicialmente en una pequeña gota de medio (generalmente unos pocos microlitros) mantenidas juntas por la tensión superficial en medio de un pozo grande18. Después de que las neuronas se unen, todo el pozo se llena con el medio mientras que las células permanecen confinadas a alta densidad en el área de chapado pequeño. Además de lograr una alta densidad de chapado, las micro islas también evitan el revestimiento cerca de los bordes de los pozos, donde las variaciones en la densidad celular y la supervivencia son frecuentes. Las micro islas se utilizan a menudo en pozos o platos relativamente grandes; sin embargo, el establecimiento de cultivos neuronales de cerebro medio en micro islas en formato de placa de 96 pozos permite el estudio de la patología de Lewy en neuronas de dopamina de buena fe con potencia de rendimiento medio a alto. Los experimentos in vitro con estas neuronas nos permitieron descubrir el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), que promueve la supervivencia de las neuronas maduras de dopamina in vitro e in vivo19,,20,,21,,22 y también previene la formación de agregados de sinucleína en las neuronas de dopamina23. Las neuronas de dopamina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el paciente humano constituyen un modelo más preciso debido a su origen humano y un tiempo de supervivencia más largo in vitro. Sin embargo, la inducción de la patología de la sinucleína en las neuronas humanas se observa después de varios meses, en comparación con una semana en las neuronas embrionarias de ratón, y / o con múltiples factores de estrés (por ejemplo, combinación de sobreexpresión de sinucleína y PFF)24,25. Además, el mantenimiento de las neuronas de dopamina humana es más costoso y laborioso en comparación con las neuronas embrionarias primarias, esencialmente limitando su uso en aplicaciones de alto rendimiento.
Además, los cultivos neuronales primarios de dopamina pueden ser modificados genéticamente (por ejemplo, con CRISPR/Cas9) y/o tratarse con agentes farmacológicos23. Constituyen una plataforma rápida y reproducible para aplicaciones como la disección de vías moleculares y el cribado de bibliotecas de fármacos. A pesar de que se puede obtener material limitado de estos cultivos, todavía es posible realizar análisis genómicos/proteómicos de pequeño tamaño. Cultivar neuronas primarias en formato 96 bien es mejor para las técnicas de microscopía de inmunocitoquímica y fluorescencia, seguido de análisis de fenotipo de alto contenido. Las imágenes de fluorescencia multiespectral derivadas de imágenes automatizadas de 96 placas de pozo se pueden convertir en resultados cuantitativos (por ejemplo, el número de neuronas que contienen LB por pozo). Dichos análisis se pueden realizar con software libre, como CellProfiler26,,27. En general, los cultivos de cerebro medio embrionario primarios en 96 placas de pozo proporcionan una plataforma robusta y eficiente para estudiar las neuronas de dopamina y la agregación de sinucleína con la oportunidad de detección de fenotipos de alto rendimiento.
La propagación de la patología de Lewy, de la cual la pS129-‘yn es un componente importante, es un sello histopatológico de PD. Detener o ralentizar la acumulación de pS129-‘min agregado puede ralentizar la degeneración de las neuronas de dopamina y la progresión de la alfa-sinucleinopatía. Sin embargo, una comprensión mecanicista de cómo la agregación pS129-‘yn contribuye a la desaparición de las neuronas de dopamina todavía tiene que ser establecida. La evidencia de estudios postmortem humanos en muestras cerebrales de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, así como la observación de la inclusión positiva de pS129-‘syn en las neuronas fetales trasplantadas sugieren fuertemente la propagación de la patología de Lewy entre las células16,,17,,33. Por lo tanto, la propagación similar a un prión de pS129-‘yn se recapitula recientementemedianteel uso de PFF de sinucleína 9,10. Establecer un modelo robusto, rentable y de rendimiento relativamente alto o medio de la propagación y acumulación de pS129-‘yn, específicamente en las neuronas de dopamina, puede acelerar considerablemente la búsqueda de nuevos tratamientos y compuestos que modifiquen este proceso.
Debido a que la pérdida de neuronas de dopamina es la principal causa de los síntomas motores en la DP y estas células poseen muchas propiedades únicas2,34,35, modelado de la propagación prion-like de pS129-‘syn en las neuronas de dopamina es el tipo más relevante de modelo desde la perspectiva traslacional. Los protocolos que utilizan cultivos de microinsulares de neuronas embrionarias de cerebro medio en 4 placas de pozos y cuantificación semiautomática se han descrito anteriormente18. El protocolo descrito aquí fue adaptado a 96 placas de pozo y proporciona una preparación menos laboriosa de las micro islas, lo que permite la preparación de hasta cuatro placas que contienen 60 pozos cada uno por un investigador experimentado durante una jornada laboral. El cultivo de neuronas de dopamina en 96 placas de pozo permite probar fármacos en cantidades más bajas y permite altas tasas de transducción con vectores de lentivirus. También es posible combinar diferentes tratamientos para realizar experimentos más complejos.
Antes de aplicar cualquier tratamiento (incluidos los F PFF), la calidad del cultivo debe comprobarse con microscopía de campo brillante. Si el sistema de microscopía no utiliza una cámara de CO2 con calentamiento, las células no deben mantenerse fuera de la incubadora durante más de un par de minutos, porque las neuronas primarias de dopamina del ratón son delicadas y fácilmente estresadas. Por la misma razón, se aconseja que la primera toma de imágenes debe hacerse después de 24 h de incubación (entre DIV1-DIV3). Las células deben parecer estar vivas con cuerpos celulares presentes y diseminadas homogéneamente dentro de la micro isla. Las neuronas primarias se habrían asentado en el suelo recubierto de PO y comenzaron a establecer proyecciones neuronales. Es posible observar pequeños grupos de células (es decir, diámetro inferior a 150–200 m) que se pueden formar si el proceso de trituración no se realiza correctamente o la densidad de chapado es mayor de lo recomendado. Estos pequeños grumos no afectarían el experimento, a menos que sean más de unos pocos por pozo y/o más. Las células agujeadas hacen que sea muy difícil identificar marcadores inmunohistoquímicos y células individuales durante el análisis de la imagen. Es esencial evitar tales grumos mediante un recubrimiento cuidadoso, trituración y control de la densidad de revestimiento. Si la uniformidad de estas condiciones no se puede observar en ciertos pozos, no incluya estos pozos defectuosos en el experimento. Dicha exclusión debe hacerse antes de la ejecución de cualquier tratamiento.
Además, la utilización de 96 placas de pozo permite un cómodo uso de pipetas multicanal durante los procedimientos de tinción y la visualización directa con microscopios automáticos de placas, aumentando aún más el rendimiento. La utilización de la cuantificación automatizada de imágenes es indispensable para el análisis de los datos de plataformas de imágenes de alto contenido. Además de la capacidad de procesar miles de imágenes obtenidas de cada experimento, garantiza una cuantificación idéntica e imparcial de todos los grupos de tratamiento. El flujo de trabajo propuesto para el análisis de imágenes se basa en principios simples de segmentación de neuronas de dopamina, filtrado de células correctamente segmentadas por aprendizaje automático supervisado, y posteriormente cuantificación de fenotipos (pS129-‘syn positivo y pS129-‘yn negativo), de nuevo por aprendizaje automático supervisado. Aunque se pueden imaginar varios enfoques diferentes para esta tarea, hemos encontrado la combinación de segmentación con aprendizaje automático para ser el más robusto para cultivos de dopamina debido a la alta densidad de chapado, las diversas formas de las neuronas de dopamina, y la presencia de neuritas fuertemente manchadas. El algoritmo de análisis de imágenes propuesto se implementó en CellProfiler y CellProfiler Analyst, de código abierto, software de análisis de imágenes de alto contenido disponible libremente26,,27. El algoritmo también podría implementarse con otro software de análisis de imágenes, ya sea de código abierto (por ejemplo, ImageJ/FIJI, KNIME) o propietario. Sin embargo, en nuestra experiencia, estos a menudo sacrifican las capacidades de personalización para facilitar su uso y, por lo tanto, podrían no funcionar bien en análisis complicados. Hemos descubierto que los paquetes de software CellProfiler y CellProfiler Analyst ofrecen resultados particularmente fiables al combinar un número sustancial de algoritmos implementados, flexibilidad extrema en el diseño del flujo de trabajo y, al mismo tiempo, el manejo y procesamiento eficiente de datos de imágenes de alto contenido.
El protocolo descrito también podría adaptarse para la cuantificación de otros fenotipos celulares caracterizados por inmunostaining con diferentes anticuerpos, como marcadores de otras poblaciones neuronales (por ejemplo, DAT, GAD67, 5-HT, etc.) y agregados de proteínas (por ejemplo, fospo-Tau, ubiquitina). Múltiples marcadores fluorescentes también podrían combinarse para distinguir múltiples fenotipos (por ejemplo, células con inclusiones en diferentes etapas de maduración). La clasificación automatizada de múltiples fenotipos también debe ser fácil de implementar en las canalizaciones de análisis de imágenes descritas simplemente agregando un canal que contenga imágenes inmunofluorescentes de marcadores adicionales a pasos de medición y clasificación de células en múltiples contenedores. Sin embargo, la utilización de múltiples marcadores al mismo tiempo requeriría la optimización de las condiciones de inmunosu manchado y de imagen. Además, para una mejor calidad en la toma de imágenes por inmunofluorescencia, se recomienda el uso de placas especiales de 96 pozos de paredes negras diseñadas explícitamente para el microscopio fluorescente. Sin embargo, estos pueden ser considerablemente más caros que las placas de cultivo celular estándar, que son suficientes para el análisis descrito en nuestro protocolo.
El tipo y la calidad de los PFF utilizados son fundamentales para el resultado de los experimentos. Tanto los FMF pueden afectar a la solidez del ensayo como a la interpretación de los resultados. Las condiciones de preparación pueden afectar a la eficiencia de siembra de los FFP y, de hecho, se han notificado “strains” PFF con diferentes propiedades fisiológicas36. No obstante, la preparación y validación de los FMF están fuera del alcance de este artículo y se han descrito en varias publicaciones11,28,29,30. Además del protocolo de preparación, se deben considerar las especies de origen de la sinucleína en los FMF (p. ej., ratón, humano) y el uso de proteínas silvestres o mutadas (por ejemplo, A53T-sinucleína humana), dependiendo de las condiciones experimentales particulares. Se demostró que la inducción de la acumulación de pS129-syn por FMF dependía de la edad del cultivo (es decir, días in vitro), con cultivos más maduros que muestran una inducción más pronunciada11. Esto es probablemente debido al aumento del número de conexiones neuronales en cultivos más maduros, y el aumento de los niveles de proteína de sinucleína. En nuestras manos, el tratamiento con PFF en DIV8 dio los resultados más robustos, con acumulación pronunciada de pS129-‘yn en el soma de la neurona de dopamina, sin comprometer la supervivencia neuronal. El protocolo descrito es adecuado para los tratamientos de estudio que modifican los primeros eventos que conducen a la agregación de la sinucleína endógena, ya que cuantificamos las inclusiones positivas de pS129-‘syn en un momento relativamente temprano, 7 días después de la inoculación con PFS. En este momento, las inclusiones intrasomales están presentes en una fracción significativa de las células y se pueden distinguir fácilmente por inmunosu mancha, mientras que no se observa la muerte celular inducida por PFF, simplificando la interpretación de los resultados. Es importante destacar que, dado que la morfología y la composición de las inclusiones inducidas por PFF pueden cambiar con el tiempo12,13, el protocolo descrito podría, en principio, modificarse para estudiar inclusiones más maduras mediante fijación e inmunosu mancha en puntos posteriores. Sin embargo, mantener las neuronas de dopamina en cultivo durante más de 15 días requiere cuidados extremos, y podría inducir variaciones adicionales debido a que las células no logran sobrevivir independientemente de la inoculación de PFF. Además, los cultivos más extendidos complican los horarios de tratamiento farmacológico. Muchos compuestos tienen estabilidad limitada o no mal caracterizada en el medio de cultivo celular, y la reposición de un medicamento no es trivial porque el intercambio completo de medio compromete la supervivencia de los cultivos de dopamina.
La fosforilación de la sinucleína en Ser129 se notifica de forma consistente en modelos basados en PFF de agregación de sinucleína y colocaciones con marcadores de desdoblamiento y agregación como Tioflavina S, ubiquitina o anticuerpos específicos de conformación11,,12. En nuestras manos, la inmunostaining para pS129-‘yn también da la señal más fuerte con el fondo más bajo y es más fácil de analizar, dando resultados robustos cuando se examinan múltiples tratamientos. Es importante destacar que la inmunostaining con anticuerpos pS129–syn no detecta los PFF que permanecen fuera de las células, reduciendo significativamente el fondo. Sin embargo, es importante recordar que la fosforilación Ser129 es probablemente uno de los primeros procesos relacionados con el desdoblamiento de la sinucleína y podría estar regulada de manera diferente en condiciones específicas. Por lo tanto, cualquier hallazgo que muestre efectos positivos sobre pS129—yn debe ser confirmado por otros marcadores.
El análisis estadístico debe adaptarse de forma correspondiente al diseño experimental. Es esencial realizar experimentos en al menos tres réplicas biológicas independientes (es decir, cultivos neuronales primarios separados). Estas réplicas deben ser chapadas en diferentes placas y tratadas de forma independiente. Analizamos los datos obtenidos a partir de réplicas en diferentes placas con diseño de bloque aleatorio ANOVA37 para tener en cuenta el emparejamiento de datos para diferentes placas experimentales.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Prof. Kelvin Luk por su generoso don de PFF de sinucleína, Conjung Zheng por establecer y cultivar células neuronales, y la Unidad de Microscopía ligera del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Helsinki para la toma de imágenes de células inmunodemintadas. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de 3i-Regeneration de Business Finland (Agencia finlandesa de financiación para la innovación), Academia de Finlandia #309489, #293392, #319195; Fundación Sigrid Juselius, y los fondos legales del Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polonia.
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |