JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Производство и характеристика макрофагов человека из плюрипотентных стволовых клеток

Published: April 16, 2020
doi:
10.3791/61038
, , , , , , ,
1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine,University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen’s Medical Research Institute,University of Edinburgh

Summary

Этот протокол описывает надежное поколение макрофагов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, а также методы их последующей характеристики. Выражение маркера поверхности клеток, экспрессия генов и функциональные анализы используются для оценки фенотипа и функции этих макрофагов, полученных от iPSC.

Abstract

Макрофаги присутствуют в большинстве тканей позвоночных и состоят из широко рассредоточенных и неоднородных популяций клеток с различными функциями. Они являются ключевыми игроками в области здоровья и болезней, действуя в качестве фагоцитов во время иммунной защиты и посредничества трофических, техническое обслуживание, и ремонт функций. Хотя удалось изучить некоторые молекулярные процессы, связанные с функцией макрофагов человека, было трудно применять методы генной инженерии к первичным макрофагам человека. Это значительно затрудняет нашу способность допрашивать сложные генетические пути, участвующие в биологии макрофагов, и создавать модели для конкретных состояний заболеваний. Таким образом, готовый источник человеческих макрофагов, поддающемся обширному арсеналу методов генетических манипуляций, станет ценным инструментом в этой области. Мы представляем оптимизированный протокол, который позволяет для генерации макрофагов из индуцированных человека плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в пробирке. Эти макрофаги, полученные из iPSC (iPSC-DMs), выражают маркеры поверхности клеток макрофагов человека, включая CD45, 25F9, CD163 и CD169, а наш функциональный анализ живой клетки изображения показывает, что они обладают надежной фагокитической активностью. Культурные iPSC-DM могут быть активированы в различных состояниях макрофагов, которые отображают измененную экспрессию генов и фагоцитарную активность путем добавления LPS и IFNg, IL4 или IL10. Таким образом, эта система обеспечивает платформу для генерации человеческих макрофагов, несущих генетические изменения, которые моделируются конкретные заболевания человека и источником клеток для скрининга наркотиков или клеточной терапии для лечения этих заболеваний.

Introduction

Эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) представляют собой самообновляющийся источник клеток, который можно дифференцировать для производства клеток всех трех родственных слоев. Технологии, которые позволяют генетические манипуляции человека плюрипотентных стволовых клеток (PSCs), таких как цинк палец Nuclease, TALENS, и CRISPR-Cas9, революцию медицинских исследований1,2,3,4. Генетические манипуляции человека PSCs является особенно привлекательной стратегией, когда первичная клетка интереса трудно расширить и / или поддерживать в пробирке, или трудно генетически манипулировать, такие, как в случае макрофогов5,6,7,8,9. Поскольку iPSCs человека могут быть получены из любой соматической клетки, они обходят этические ограничения, связанные с ESCs, и обеспечивают стратегию для доставки персонализированной медицины. Это включает в себя пациента конкретных заболеваний моделирования, тестирование на наркотики, и аутологичной клеточной терапии с пониженным риском иммунного отторжения и инфекции6,8,10,11.

Протоколы, описывающие генерацию макрофагов из iPSCs, состоят из трехступенчатого процесса, который включает в себя: 1) Поколение эмбриональных тел; 2) Появление гематопогетических клеток в суспензии; 3) Терминальное созревание макрофагов.

Формирование трехмерных агрегатов, известных как эмбриональные тела (EBs) инициирует дифференциацию iPSCs. Костяно-морфогенетический белок (BMP4), фактор стволовых клеток (SCF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) добавляются для привода мезодерм спецификации и поддержки новых гематопогетических клеток7,8,9,11,12. Дифференивающие клетки в Пределах ЕБ также инициируют активацию эндогенных сигнальных путей, таких как Wnt и Activin. Некоторые протоколы дифференциации не проходят стадию формирования ЕБ. В этих случаях, Wnt и Activin сигнализации регуляторов, таких как рекомбинантный человека Активин И / или Chiron добавляются к дифференциации iPSCs в монослой номинала формат13,14,15. Здесь мы сосредоточимся на протоколе, который использует формирование EB. Для второго шага дифференциации, EBs покрываются на поверхность адепта. Эти прикрепленные клетки затем подвергаются воздействию цитокинов, которые способствуют появлению подвесных клеток, которые включают гематопоитические и миелоидные прародители. В этих условиях культуры in vitro, интерлейкин-3 (IL3), вероятно, поддерживает гематопоиетическое образование стволовых-прародителей клеток и пролиферации16,17, а также миелоидные прекурсоры пролиферации и дифференциации18. Макрофаг колонии стимулирующий фактор (CSF1) поддерживает производство миелоидных клеток и их дифференциации на макрофаги19,20. На третьем этапе дифференциации эти подвесные клетки культивируются в присутствии CSF1 для поддержки созревания терминального макрофагов.

Дифференциация iPSCs человека в макрофаги in vitro имитирует раннюю волну производства макрофагов во время развития. Ткань-резидент макрофаги устанавливаются во время эмбриогенеза и имеют четкую линию развития от взрослых моноцитов. Несколько исследований показали, что iPSC-DMs имеют генную подпись, которая более сопоставима с макрофагами, полученными из печени, чем с биоцитами, полученными из крови, предполагая, что iPSC-DM больше похожи на макрофаги, проживающие в тканях. iPSC-DMs выражают более высокий уровень генов, которые кодируют для секреции белков, участвующих в ремоделировании тканей и ангиогенеза и выражают более низкие уровни генов, кодирующих для провоспалительных секреции цитокинов и антигенной презентации деятельности21,22. Кроме того, iPSC-DMs имеют аналогичное требование коэффициента транскрипции к макрофагам23,,24. Использование линий клеток нокаута iPSC, недотечанных в транскрипционных факторах RUNX1, SPI1 (PU.1) и MYB, Buchrieser et al. показало, что генерация iPSC-DMs зависит от SPI1 и RUNX1, но зависит от MYB. Это указывает на то, что они транскрипически похожи на желток-мешок производных макрофагов, которые генерируются во время первой волны гематопоезии во время развития23. Таким образом, широко признается, что iPSC-DMs представляют собой более подходящую модель клеток для изучения тканей резидентов макрофагов, таких как микроглии14,,25 и Kupffer клетки11, и более желательным источником клеток, которые потенциально могут быть использованы в терапии для восстановления тканей. Например, было показано, что макрофаги, производимые в пробирке из мыши ESCs были эффективными в улучшение фиброза в CCl4-индуцированной модели травмы печени in vivo11. Кроме того, эти макрофаги, полученные из ESC, были более эффективными, чем макрофаги костного мозга при перенаселенности клеточных отсеков Купффера, истощенных макрофагами с помощью липосомального кклодроната11 у мышей.

Здесь мы описываем протоколы без сыворотки и фидера для обслуживания, замораживания и оттаивания iPSCs человека, а также для дифференциации этих iPSCs в функциональные макрофаги. Этот протокол очень похож на описанный Ван Вильгенбургом и др.12, с незначительными изменениями, включая: 1) iPSC-обслуживание средств массовой информации; 2) ингибитор ROCK не используется на стадии формирования EB; 3) Механический подход, а не ферментативный подход используется для создания единообразных EBs из колоний iPSC; 4) Метод сбора урожая и покрытия EB отличается; 5) Подвесные клетки собирают 2 раз в неделю, а не еженедельно; и 6) Собранные подвесные клетки культивируются под CSF1 для созревания макрофагов в течение 9 дней, а не 7 дней. Мы также описываем протоколы, используемые для характеристики phenotype и функции макрофагов, полученных из iPSC, включая анализ экспрессии генов (qRT-PCR), экспрессии маркера поверхности клеток (цитометрия потока) и функциональных анализов для оценки фагоцитоза и поляризации.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты и оборудование, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов. Средства массовой информации должны быть на уровне 37 градусов по Цельсию для клеточной культуры. Средства массовой информации и реагенты, используемые в протоколе дифференциации, должны быть стерильными. 1. Человек iPSC линии таяния и технического обслуживания Подготовьте среду обслуживания клеток, факторы роста и другие реагенты. Подготовьте hESC-сывороточный свободный носитель (hESC-SFM; см. Таблица материалов) путем дополнения модифицированного Орла Dulbecco medium-F12 (DMEM/F12) с дополнением hESC, 1,8% w/v сывороточку сыворотки (BSA), и 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол. ( Подготовьте основной фактор роста фибробластов человека (bFGF) стоковый раствор (10 мкг/мл) путем растворения bFGF в стерильных 0,1% человеческого сывороточного альбумина (HSA)-фосфат буферного солей (PBS) раствора. Распределите биржевое раствор в виде 200 аликветов в криотубесе. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 1 года. После оттаять, акции bFGF могут храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 7 дней. Подготовьте ингибитор ро киназы (ИНГибитор ROCK)-Y27632 стокового раствора (1 мг/мл) путем растворения его в стерильной воде. Распределите биржевое решение в виде 50 аликотов в криотубетах. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 1 года. После размораживания, запас ROCK ингибитор может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 7 дней. Разбавить подложку стволовых клеток (см. Таблицу Материалов)1:50 в фосфатном сосудистом сале Dulbecco с кальцием и магнием. Поместите раствор разбавленного стволового клеточного субстрата на культурные пластины, чтобы конечный объем на площадь поверхности составлял 78 л/см2. Чтобы покрыть колодец 6-й пластины, добавьте 750 л раствора. Инкубировать покрытую пластину на 1 ч в humified атмосфере при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Аспирировать покрытие субстрата стволовых клеток и добавить 1 мл hESC дополнены 20 нг/мл bFGF и 10 мкм ROCK ингибитор. Чтобы разморозить флакон замороженных клеток iPSC человека, инкубировать флакон при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока не разморозить и передать клетки в 5 мл hESC-SFM средств массовой информации. Клетки центрифуги при 100 х г в течение 3 мин. Повторное действие в 0,5 мл hESC-SFM дополнено 20 нг/мл bFGF и 10 мкм ИНГибитором ROCK. Перенесите клетки в хорошо покрытую. Культурные ячейки на 24 ч. Изменение носителя на hESC-SFM дополнено 20 ng/mL bFGF, но без ингибитора ROCK. Для поддержания клеток, изменить среду каждый день, пока клетки достигают 80% выпуклости. Недифференцированные iPSCs обычно принимают 3-4 дня для того чтобы достигнуть 80% confluency. После того, как клетки достигли 80% выпуклости, проход ные клетки. Замените отработанную среду культуры 1,5 мл свежего hESC-SFM, дополненного 20 нг/мл bFGF (без ингибитора ROCK). Держите сосуд культуры в одной руке и сверните одноразовый инструмент пропуская клетки (см. Таблица материалов)через плиту в одном направлении (т.е., слева направо). Все лезвия в ролике должны касаться пластины. Поддерживайте равномерное давление во время прокатки. Повторите прокат в одном направлении до тех пор, пока вся скважина не будет покрыта. Поверните сосуд культуры 90 “и повторить прокат, как описано в шагах 1.12.2 и 1.12.3. Откажитесь от инструмента пропуска после использования. С стерильным пипеткой, используйте средства массовой информации в колодце, чтобы выбить вырезать колоний. Передача клеток в соотношении 1:4 на предварительно расчехленные скважины подлодки стволовых клеток (шаги 1,2-1,5) в конечный объем носителя (hESC-SFM дополнен 20 нг/мл bFGF) 1,5 мл на скважину. 2. Замораживание линии iPSC Чтобы заморозить iPSC клетки, заменить средства массовой информации 70%-80% слияние хорошо 6 хорошо пластины с hESC-SFM дополняется 20 нг / мЛ bFGF и 10 мКМ ROCK ингибитор. Хорошо инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 1 ч. Вырезать колонии с помощью инструмента пропуска клеток и место выбили колоний в центрифуге трубки. Клетки центрифуги при 100 х г в течение 3 мин. Приготовьте средства массовой информации и повторно йприостановить клетки в 1 мл клеточной криоконсервации средств (см. Таблица материалов). Разделите клетки поровну на два криовиала и поместите их в предварительно охлажденный контейнер криоконсервации клеток при 4 градусах Цельсия. Храните ячейки при -80 градусах по Цельсию при 24-48 ч. Перенесите флаконы либо в морозильную камеру -135 градусов, либо в резервуар с жидким азотом. 3. Дифференциация человека iPSC к макрофагам ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая сводка протокола дифференциации макрофагов изображена на рисунке 1. Подготовка факторов динамики клеток и других реагентов Подготовьте медиа-носителю hESC-SFM (см. предыдущий раздел). Приготовьте 0,1% w/v раствор свиного желатина путем растворения желатина в стерильную воду. Раствор желатина можно хранить при 4 градусах Цельсия в течение 2 лет. Подготовьте человеческий бульонный раствор BMP4 (25 мкг/мл) путем растворения BMP4 в хлорид водорода 4 мМ (HCl)-0,2% раствора BSA PBS. Распределите биржевое решение в виде 50 аликотов в криотубетах. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 1 года. После размораживания, запас BMP4 может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 5 дней. Подготовьте решение для запасов VEGF (100 мкг/мл) путем растворения VEGF в решение BSA PBS 0,2%. Распределите биржевое решение в виде 10 аликотов в криотубетах. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 1 года. После оттаять, запас VEGF может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 7 дней. Подготовьте решение для запасов SCF (100 мкг/мл) путем растворения SCF в раствор BSA PBS 0,2%. Распределите биржевое решение в виде 5 аликотов в криотубетах. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 1 года. После размораживания, запас SCF может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 10 дней. Подготовьте человеческий складской раствор IL3 (10 мкг/мл) путем растворения IL3 в раствор BSA PBS 0,2%. Распределите биржевое решение в виде 500 аликветов в криотубесе. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 2 лет. После размораживания, запас SCF может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 15 дней. Подготовьте человеческий складской раствор CSF1 (10 мкг/мл) путем растворения CSF1 в раствор BSA PBS 0,2%. Распределите стоковое решение в виде 1 мл aliquots в криотубесе. Фондовые растворы могут храниться при -20 градусов до 2 лет. После размораживания, запас SCF может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 15 дней. Подготовьте отдельные 10 мг/мл стоковых растворов интерферона-гаммы (IFNg), интерлейкина 4 (IL4) и интерлейкина 10 (IL10) путем растворения в 0,2% растворов BSA PBS. Приготовьте липополисахарид (LPS) к биржевому раствору (100 U/mL) путем растворения в растворе bsA PBS 0,2%. Распределите каждое акционерное решение в виде 35 аликветов. Хранить при -80 градусах По Цельсию до 2 лет. После размораживания запасы могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 7 дней. Этап 1: Поколение эмбриональных тел (день 0-день 3) На день 0, добавьте 2.25 ml носителя 1 этапа (hESC-SFM дополнено с 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, и 20 ng/mL SCF) в 2 скважины ультранизкого приложения 6 наилучшим образом плиты. Замените техническое обслуживание носителя одного 80% сопливого хорошо iPSCs в 6 хорошо пластины с 1,5 мл стадии 1 средств массовой информации. Вырезать колонии с помощью клеточного проходного инструмента и передачи сократить колоний с пипеткой в двух колодцев ультра-лоу вложения 6 хорошо пластины (см. Таблица материалов). На второй день довести цитокины до конечной концентрации 50 нг/мл BMP4, 50 нг/мл VEGF и 20 нг/мл SCF с использованием 0,5 мл средств массовой информации hESC-SFM.ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии IPSC станут EBs(рисунок 2A). Этап 2: Появление гематопогетических клеток в суспензии На 4-й день, пальто 4 колодца 6 хорошо ткани культуры пластины с 0,1% w/ v желатин и инкубировать, по крайней мере 10 мин. Удалить желатин и добавить 2,5 мл стадии 2 средств массовой информации (X-VIVO15 дополнен100 нг/мл CSF1, 25 нг/мл IL-3, 2 мМ глутамакс, 1% пенициллин-стрептомицин, и 0,055 мМ 2-меркаптоэтанол). Соберите сформированные EBs в 50 mL центрифуги трубки и позволяют им оседать в нижней части трубки под действием силы тяжести. Тщательно аспирируйте средства массовой информации. Resuspend EBs в 2 мл носителя 2-го этапа. Передача 10-15 EBs (не более 15) в скважину с покрытием с желатином, содержащую 2,5 мл носителей 2-го этапа. Инкубировать EBs при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 воздуха. Изменение носителя на покрытием EBs каждые 3-4 дней в течение 2-3 недель. После 2-3 недель, EBs начинают выпускать непридерживающиеся гематопоатические клетки в подвеску.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот период высвобождения клеток подвески может варьироваться и зависит от клеточной линии. Клетки в этой подвеске могут быть собраны и созрели в макрофаги (см. Этап 3)(рисунок 2A). Этап 3: Созревание макрофагов терминала Соберите подвесные гематопоитические клетки и пополните медиа (Этап 2-й носители) на пластине EB. Центрифуги подвесной клетки на 200 х г в течение 3 мин. Приостановить подвески клеток в этапе 3 средств массовой информации (X-VIVO15 дополнен10 нг /мл CSF1, 2 мМ глутамакс, и 1% пенициллин-стрептомицин). Плита собрана и закручена клетки на необработанные пластиковые 10 см бактериологического класса пластин (10 мл) или без покрытия 6 хорошо ткани культуры пластин (3 мл) при плотности 0,2 х 106 клеток / мл. Храните ячейки в носителях 3-й стадии в течение 9–11 дней, меняя носители каждые 5 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.4.1-3.4.5 от этапа 3 можно повторить каждые 3-4 дня и клетки подвески собранные от первоначально плиты EB на up to 3 месяца. Макрофаг поляризация Для активации макрофагов в фенотип M (LPS и IFNg) стимулируйте клетки с LPS (окончательная концентрация: 100 нг/мл) и IFNg (окончательная концентрация: 10 U/mL) для 48 ч. Чтобы активировать клетки в фенотип M (IL4), стимулировать клетки с IL4 (окончательная концентрация: 20 нг/мл). Чтобы активировать в фенотип M (IL10), стимулировать макрофаги с IL10 (окончательная концентрация: 5 нг/мл). 4. iPSC-производные Макрофаги Контроль качества Проверка Определите количество гематопоитических подвесных клеток, вырабатываемых на 6 скважинных пластине ЭБ, считая их гематоцитометром. Оцените морфологию макрофагов, как описано ранее (например, окрашивание коммерческого комплекта)8,,9. Обнаружить экспрессию макрофагов конкретных маркеров и маркеров поляризации с помощью анализа экспрессии генов и цитометриипотока,как ранее описано8,9. Для экспериментов цитометрии потока на одной скважине из 6 колодцей макрофагов, уборочных клеток, укрепляя их созревание, мыть с 2 мл PBS, и инкубировать их с 2 мл фермента свободной диссоциационнов цисоциационизации буфера в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Пипетка вверх и вниз неоднократно отсоединять и собирать макрофаги. Подсчитайте клетки с гематоцитометром и повторно притяните их в 80 зл 2% BSA, 0,5 мм этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА)-PBS раствор. Добавьте 20 Зл MACS человека FC блокатор. Инкубировать на льду в течение 20 минут и защитить от света. Добавьте соответствующий объем 2% BSA, 0,5 мм EDTA PBS решение довести концентрацию клеток до 1 х 106 макрофагов / мл. Пятно 1 х 105 клеток в 100 л 2% BSA, 0,5 мм EDTA PBS раствор с соответствующими антителами (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже) и инкубировать в течение 15 минут на RT защищенота от света. Вымойте 1x с по крайней мере 100 л 2% BSA, 0,5 мМ EDTA PBS. Повторное увеличение клеток в 200 л 2% BSA, 0,5 мм EDTA PBS. Добавьте 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, разбавленный 1:1,000) в качестве живого мертвого красителя. Инкубировать 3 мин. Для анализа цитометрии потока, ворота на основной популяции, затем одиночные клетки, а затем живые клетки. На живой популяции клеток, макрофаг связанных маркер выражение очевидно(Рисунок 3A).ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела должны быть тщательно титра для каждой линии клеток, используемых для получения макрофагов. Антитела, представленные в разделе результатов, находятся в таблице материалов. Коэффициент разбавления для SFCi55 полученных макрофагов потока цитометрии анализы также включены. 5. Высокая пропускная часть Фагоцитоз Ассай Урожай iPSC полученных макрофагов (iPSC-DMs) путем аспирации средств массовой информации, добавив ледяной фермент свободной клеточной диссоциации буфера, и инкубации в течение 5 мин. Соберите макрофаги путем трубач неоднократно. Плита 8 х 104 iPSC-DMs в колодце ткани изображения культуры класса 96 хорошо пластин (например, Cellcarrier Ultra, Перкин Элмер) по крайней мере за 2 дня до высокой пропускной записи в 200 Зл этапе 3 средств массовой информации. Подготовка pHrodoGreen Зимосан-Биочастицы, resuspending один флакон в 2 мл PBS (“Решение 1”). Раствор Vortex на 10 с. Разбавить 2 мл подвески pbS бибы 1:5 с более PBS (“Решение 2”). Sonicate Решение 2 для 8 с и вихревой раствор для 10 s. Держите его при 4 градусах Цельсия. Это решение будет использоваться в шаге 5.11. Удалите носители на покрых iPSC-DM и помойте PBS. Пятно iPSC-DMs с раствором PBS, содержащим Hoechst 33342 разбавленной 1:20. Инкубировать в течение 20 мин при 37 градусах По Цельсию. Вымойте клетки с помощью PBS. Пятно с раствором PBS, содержащим глубокое красное плазменное мембранное пятно, разбавленное 1:1,000 (см. Таблица Материалов). Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия. Вымойте клетки с помощью PBS. Добавьте 100 л раствора бисора, который хранится при 4 градусах Цельсия к каждой скважине iPSC-DM. Пластины теперь готовы к визуализации. Изображение пластины с помощью системы изображений высокого содержания и приобрести три или более полей через колодец, чтобы получить хорошее представление скважины. Количественное фагоцитоз с помощью программного обеспечения Columbus (программное обеспечение системы анализа высокой степени содержания изображений). Для однозначного анализа пакетных изображений может быть разработан конкретный алгоритм: Измерьте синюю интенсивность и определите в программном обеспечении, что синий сигнал указывает на ядра. Измерьте красную интенсивность и определите в программном обеспечении, что красный сигнал указывает на цитоплазму. Определите, что ядро и цитоплазма вместе соответствуют клетке. Измерьте зеленую интенсивность в клетках и установите строгое значение отсечения/порога, чтобы считать клетку фагоцититарной. Количественная фагоцитарная фракция и средний фагоцитный индекс на клетку. Поскольку интенсивность цвета бисера пропорциональна количеству бусинок, фагоцитарная активность может измеряться количеством пропающих бисера. Примените алгоритм/конвейер ко всем изображениям в каждой области и во все моменты, полученные в установленные сроки, что позволяет применять надежный и беспристрастный пакетный подход для определения фагоцитических возможностей клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Columbus — это программное обеспечение для анализа высокого содержания, которое предлагает анализ сегментации клеток для фенотипирования клеток и функционального тестирования.

Representative Results

Прогрессия дифференциации, число макрофагов и морфологияРезультаты представлены из дифференциации SFCi55 человека iPSC линии, которая была описана и использована в ряде исследований8,9,10,26. Процесс дифференциации IPSC по отношению к макрофагам можно контролировать с помощью оптической микроскопии. iPSC колонии, эмбриональные тела (EBs), гематопоитические клетки подвески, и зрелые макрофаги были морфологически различных(рисунок 2A). Зрелая морфология макрофагов может быть дополнительно подтверждена путем окрашивания центрифуговых цитоспинных препаратов. Макрофаги, полученные из IPSC, были большими и имели одиночные небольшие овальные ядра и обильные цитоплазмы, содержащие много пузырьков(рисунок 2B). Первые 2 недели гематопоитических подвесных клеток собирают (дни 16-28) одной полной 6 скважинной пластины ЭБ, содержащей в среднем, 2,59 х 106 и 0,54 клетки. После 28-го дня было произведено в среднем 4,64 х 106 и 0,94 подвесных ячеек на 6 скважине EBs. Начиная со дня 80 года, количество подвесных клеток начало падать по мере того, как EBs становятся исчерпанными(рисунок 2C). Рекомендуется прекратить протокол дифференциации после того, как цифры опускаются ниже 3 х 106 прекурсоров на урожай на 6 скважинную пластину ЭБ. Выражение маркеров поверхности поверхности клеток, полученных IPSC,Цитометрия потока остается наиболее распространенным методом, используемым для оценки фенотипа человеческих макрофагов. Стратегия gating для того чтобы определить выражение маркера поверхности клетки consist of gating основная населенность клеток используя физические параметры как размер и гранулированность, последовано за gating одиночными клетками и после этого клетками в реальном маштабе времени (рисунок 3A). Зрелые макрофаги, полученные из iPSC, должны выражать маркер линии CD45 и маркер созревания макрофагов 25F9 и быть отрицательным для моноцитов/незрелых макрофагов маркера CD93. Это согласуется с нашими наблюдениями(рисунок 3A). Макрофаги, полученные из IPSC, также были положительными для линейных миелоидных маркеров CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 и CD169 (Рисунок 3B). Они были положительными для иммуномодуляции маркер CD86, и небольшая часть из них выразили хемокиновых рецепторов CX3CR1, CCR2, CCR5, и CCR8 в наивном состоянии (Рисунок 3B). Участки были получены на основе данных, ранее опубликованных нашей лабораторией8. iPSC полученных макрофагов фагоцитоз и поляризацияОдной из ключевых особенностей макрофагов в защите принимающих и тканей гомеостаза является их способность к фагоцитозным патогенам, апоптотические клетки и мусор27. Скорость фагоцитоза тесно связана с конкретными фенотипическими состояниями28. Для оценки фагоцитной способности iPSC-DM мы использовали высокое содержание системы визуализации подход8,,9,11, что использует PerkinElmer оперетта Микроскоп и pHrodo Зимосан биочастиц (pH-чувствительный краситель конъюгатов). Биочастицы были нефторесцентными при добавлении в культуры(Рисунок 4A), но флуоресцентный ярко-зеленый внутриклеточной кислой рН(рисунок 4B). В живом изображении Оперетта микроскоп был установлен на изображение каждые 5 минут после добавления бисера в общей сложности время 175 мин. Трубопровод анализа высокой пропускной связи и непредвзятый образ был затем использован на платформе Columbus для количественной оценки активности с точки зрения фагоцитарной фракции, которая представляет собой пропорцию клеток, которые фагоцитоза бисера и фагоцитового индекса, который является мерой количества шариков, которые попадает в каждую клетку. Макрофаги могут реагировать и изменять свой фенотип в зависимости от экологических сигналов. Чтобы оценить их способность реагировать и изменяться при экологических стимулах, iPSC-DMs можно лечить lpS и IFNg, IL4 или IL10. После 48 ч лечения, они изменили фенотип, в этом случае называют M (LPS и IFNg), M (IL4), и M (IL10), соответственно29. Анализ экспрессии генов является полезным инструментом для проверки состояния поляризации макрофагов. При стимуляции LPS и IFNg макрофаги upregulated мРНК выражение генов CD40, VCAM1, и TNFA (Рисунок 5A). При стимуляции IL4 клетки upregulated мРНК выражение генов CD68, CD84,и MRC1 (Рисунок 5B). После стимуляции IL10, iPSC-DMs upregulated выражение MRC1 (Рисунок 5B). Что касается фагоцитоза, макрофаги, обработанные LPS и IFNg или IL4 показали значительно меньший процент фагоцитических клеток по сравнению с наивными макрофагами. iPSC-DMs, обработанные IL10, показали повышенный процент фагоцитных клеток и фагоцитового индекса(рисунок 5C-E). Рисунок 1: Графическое резюме дифференциации iPSC на зрелые функциональные макрофаги. Диаграмма, нарисованная с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: дифференциация iPSC по отношению к макрофагам и количеству iPSC-DM и морфологии. (A) Яркие полевые изображения, полученные из (слева направо): колония IPSC, эмбриональные тела (EBs), собранные подвесные клетки и зрелые макрофаги. Шкала бар 100 мкм. (B) Изображение макрофаговых цитоспинов, окрашенных комплектом Kwik-diff. Шкала бар 25 мкм. (C) Количество подвесных клеток, собранных на урожай на одну 6 скважинную пластину ЕБ. Участок показывает, означает SEM; (n No 6 биологически независимых экспериментов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Фенотип поверхности поверхности макрофагов. (A) Стратегия Gating для анализа зрелых макрофагов, полученных iPSC. Одноместные, живые клетки были закрыты, а затем проанализированы для выражения маркеров поверхности клеток CD45, CD93 и 25F9. Ворота для маркеров поверхности клеток были нарисованы с помощью флуоресценции минус один (FMO) управления. (B) Представитель потока цитометрических гистограмм для одного пятна iPSC-DMs (синий) и изотип управления (серый) для линии и миелоидных маркеров, иммуномодуляции маркеров, маркеров созревания, и хемокин рецепторов. Сюжеты являются репрезентативными для n No 5 биологически независимых экспериментов для всех линейных и миелоидных маркеров, за исключением CD105 и CD206 (n no 3); маркеры созревания (n No 5); иммуномодуляционные маркеры (n No 3); и хемокинские рецепторы (n No 3). Участки используют ранее опубликованные данные8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: поляризация IPSC-DM и анализы фагоцитоза. Представитель изображения iPSC-DMs(A) сразу же после добавления зеленых бусинок ymosan pHrodo и (B) 175 мин после добавления бисера. Синий цвет представляет ядра клеток; красный цвет представляет цитоплазму клеток. Зеленый цвет представляет пропажу бусин (шкала бар 20 мкм). (C) Фракция фагоцитных макрофагов и (D) фагоцитный индекс / зеленая интенсивность на фагоцитный макрофаг с течением времени в наивном состоянии (n No 6 биологически независимых экспериментов). Участки показывают среднее значение и бары представляют SEM. Участки используют ранее опубликованные данные8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Оценка состояний поляризации iPSC-DM. Относительная количественная оценка РТ-ПЦР-анализа наивных и поляризованных iPSC-DM для оценки экспрессии (A)M (LPS-IFN);; (B) M (IL4) и M (IL10)-связанные гены (n no 6 биологически независимых экспериментов; Несколько сравнений ВОВ ИНОВА и Холм-Сидак после теста. Поляризованные группы были статистически по сравнению с наивной группой). Участки показывают среднее значение, а бары ошибок представляют стандартное отклонение. ND в участках и стенограмма не обнаружена. Данные по этим участкам были ранее опубликованы8. (C) Репрезентативные изображения iPSC-DMs 175 мин после добавления бусин pHrodo из iPSC-DMs, обработанных (слева направо): нет цитокинов, LPS-IFN-Y, IL-4 и IL-10 (шкала бар 20 мкм). (D) Фракция фагоцитных макрофагов и (E) фагоцитный индекс / зеленая интенсивность на фагоцитарный макрофаг в наивных и поляризованных макрофагов лечения 175 мин после добавления бисера (n No 12 биологически независимых экспериментов, односторонней ANOVA и Холм-Сидак несколько сравнений после теста. Поляризованные группы были статистически по сравнению с наивной группой). Сюжеты показывают среднее значение, а бары ошибок представляют собой стандартное отклонение (пч ч. 0; 0,05, пч lt; 0,01, «p lt»; 0.001, «p»lt; 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Протокол для генерации iPSC-DMs, описанный здесь, является надежным и позволяет выравлить большое количество однородных клеток из относительно небольшого числа iPSC. После первоначальной дифференциации примерно 1 х 106 iPSCs, последующие культуры могут быть собраны каждые 4 дня в течение 2-3 месяцев, в результате чего производство по крайней мере 6,5 х 107 макрофагов за это время. Эти макрофаги человека, генерируемые в пробирке, морфологически похожи на первичные макрофаги человека, выражают ключевые маркеры поверхности клеток макрофагов и проявляют фагоцитную активность. Протокол для дифференциации макрофагов воспроизводим и может быть применен к другим линиям клеток hiPSC и hESC, но точное время первого урожая прекурсоров макрофагов и абсолютное количество клеток, которые могут быть сгенерированы, варьируется между линиями iPSC.

Было продемонстрировано, что макрофаги могут быть сгенерированы из iPSCs, которые были генетически манипулировать. Например, трансгенная кассета, состоящая из флуоресцентного репортера SSGreen под контролем конситутного промоутера CAG, была вставлена в локус AAVS1 линии SFCi55 iPSC, и впоследствии было показано, что эта линия iPSC может быть дифференцирована в макрофаги8. Эти флуоресцентные макрофаги могут быть использованы в будущем для отслеживания миграции и стабильности терапевтических макрофагов в моделях болезни. В другом исследовании, макрофаги были созданы из линии iPSC, которые были генетически манипулировать, чтобы выразить тамоксифен индуцированной транскрипции фактор KLF1. Активация KLF1 в макрофагах, полученных iPSC, привела к выработке макрофагов с фенотипом, сравнимым с макрофагами острова эритроид9. Потенциально, эта стратегия может быть использована для генетически программы iPSC полученных макрофагов в фенотипы, связанные с другими ткани конкретных макрофагов популяций, таких как Kupffer клетки печени или Langerhans клеток кожи. Это станет возможным после выявления ключевых факторов транскрипции, определяющих эти типы клеток.

С точки зрения протокола, очень важно отметить, что состояние стартовой популяции iPSCs имеет решающее значение для успешной дифференциации. Человеческие культуры iPSC могут быть переполнены кариотипично аномальными субпопуляциями в течение нескольких проходов, поэтому рекомендуется надежная кураторства запасов iPSC и крупных запасов мастер-пакетов, подвергаемых контролю качества генома. В наших руках, протоколы обслуживания, описанные здесь, могут поддерживать кариотипично нормальные iPSCs в течение 2 месяцев в непрерывной культуре, но это может варьироваться для различных клеточных линий и в различных лабораториях. При возникновении проблем рекомендуется использовать свежий флакон недифференцированных iPSCs для каждого эксперимента дифференциации. Кроме того, начальная культура недифференцированных iPSCs должна быть не более 80% конфлюента. На этапе покрытия EB, только 10-15 EBs должны быть покрыты на хорошо 6 хорошо ткани культуры пластины, и очень важно, чтобы эти EBs равномерно распределены по скважине. Большее количество ЭБ и/или слипание ЭБ в центре скважины негативно сказалось на количестве генерируемых макрофагов. Следует принимать меры при пополнении носителей и сборе моноцитов, как клетки подвески прародителя из EB культур, чтобы избежать нарушения слипания Эб на поверхность покрытые пластины культуры. Количество гематопоитических подвесных клеток, производимых постепенно увеличивается с каждым урожаем, с оптимальным производством между днями 40-72 дифференциации(рисунок 2). Производство постепенно снижается после 68-го дня, и пластины, как правило, высаживаются через 2,5 месяца, хотя точное время может варьироваться в зависимости от линии iPSC.

Одним из ограничений нашего протокола является то, что не удалось криоконсервировать гематопоитические подвесные клетки, генерируемые в конце 2-го этапа. Протоколы, которые полагаются на экзогенную активацию WNT, сообщают о 40% коэффициенте восстановления после криоконсервации, но эти протоколы сообщают только об одном собирании клеток, поэтому абсолютное число генерируемых макрофагов является низким30. Описанный здесь протокол, вызывающий эндогенную сигнализацию через образование ЕБ, можно собирать раз в неделю, создавая гораздо более высокую общую урожайность макрофагов.

Таким образом, мы представляем подробный протокол для производства функциональных макрофагов, полученных от iPSC. Создание экспериментов в пробирке с макрофагами, полученными из iPSC, для изучения биологии макрофагов в области здоровья и болезней, имеет много преимуществ по сравнению с экспериментами с макрофагами, полученными из моноцитов (МДМ). Эти преимущества включают в себя простоту доступа к материалу (например, доноры не требуются), очень большое количество макрофагов может быть произведено, и это возможно и относительно просто производить генетически модифицированные макрофаги. Кроме того, макрофаги, полученные из iPSC, могли бы быть лучшим ресурсом для изучения биологии макрофагов, проживающих в тканях.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Фиону Росси и Клэр Крайер за помощь в цитометрии потока, Эогана О’Дуйбхира и Бертрана Верне с микроскопией. Эта работа была профинансирована CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) и Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD Studentship (A.M),MRC Precision Medicine Studentship (T.V). Л.К. и J.W.P. были поддержаны Wellcome Trust (101067/З/13/) и Советом по медицинским исследованиям (MR/N022556/1) и COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

Materials

2-Mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350010
Abtibody CD64-APC -CY7 Biolegend 305026 Dilution factor: 1:100
Antibody 25F9-EFLUOR 660 Ebioscience 15599866 Dilution factor: 1:20
Antibody CCR2-PE-Cy7 Biolegend 357212 Dilution factor: 1:100
Antibody CCR5 PE Biolegend 313707 Dilution factor: 1:100
Antibody CCR8 PE Biolegend 360603 Dilution factor: 1:100
Antibody CD11b-PE Biolegend 301305 Dilution factor: 1:50
Antibody CD14-APC Ebioscience 10669167 Dilution factor: 1:20
Antibody CD163-PE-CY7 BIolegend 333614 Dilution factor: 1:25
Antibody CD169-APC Biolegend 346007 Dilution factor: 1:25
Antibody CD206-PE Biolegend 321106 Dilution factor: 1:100
Antibody CD209-PE-CY7 Biolegend 3310114 Dilution factor: 1:100
Antibody CD274-PE-CY7 Biolegend 329718 Dilution factor: 1:100
Antibody CD43-PE Ebioscience 10854419 Dilution factor: 1:100
Antibody CD45-APC Ebioscience 15577936 Dilution factor: 1:20
Antibody CD86-APC Biolegend 305412 Dilution factor: 1:100
Antibody CD93-PE Ebioscience 10804637 Dilution factor: 1:100
Antibody CX3CR1-PE Biolegend 307650 Dilution factor: 1:100
Antibody HLA-DR-BV650 Biolegend 307650 Dilution factor: 1:100
Antiboy CD115-PE Biolegend 347308 Dilution factor: 1:40
Cell Dissociation Buffer, enzyme free Thermofisher 13151014
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS Gibco 13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well PerkinElmer 6055302
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain Thermofisher C10046 Cryopreservation media
Cryostor CS10 Sigma C2874
CTS CELLstart Substrate Invitrogen A1014201 Stem cell substrate
DAPI Merck D9542-1MG Final concentration 1 μg/mL
DPBS, calcium, magnesium (500ml) Thermofisher 14040091
FcR Blocking Reagent, human MACS Miltenyi Biotec 130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein Thermofisher PHG0021
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IFNY Thermofisher 14-8319-80
Human Serum Albuminum Irvine Scientific 9988
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli Sigma L2630
NucBlue (Hoechst33342) Thermofisher R37605
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis Thermofisher P35365
Porcine Skin Gelatin Sigma G9136
Recombinant Human BMP4 Protein R&D 314-BP-010
Recombinant Human IL10 Preprotech 200-10
Recombinant Human IL3 Preprotech 200-03-10
Recombinant Human IL4 Preprotech 200-04
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug Biolegend 574806
Recombinant Human VEGF Protein R&D 293-VE-010
Rock Inhibitor Y-27632 Merck SCM075
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein Thermofisher PHC2111
StemPro hESC SFM Thermofisher A1000701
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool Thermofisher 23181010
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface Greiner 657970
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
X-Vivo 15 500 mL bottle Lonza BE02-060F
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Focosi, D., Amabile, G. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  5. Lachmann, N., et al. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).
  6. Kuhn, A., et al. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  7. Ackermann, M., et al. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).
  8. Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).
  9. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881 (2019).
  10. Cassetta, L., et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).
  11. Haideri, S. S., et al. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).
  12. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  14. Douvaras, P., et al. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  15. Heideveld, E., et al. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).
  16. Leary, A. G., et al. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).
  17. Robin, C., et al. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).
  18. Moldenhauer, A. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56 (2008).
  19. Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).
  20. Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).
  21. Klimchenko, O., et al. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).
  22. Alasoo, K., et al. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , 1-15 (2015).
  23. Buchrieser, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  24. Vanhee, S., et al. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).
  25. Abud, E. M., et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  26. Yang, C. -. T., et al. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
  27. Karavitis, J., Kovacs, E. J. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).
  28. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  29. Murray, P. J., et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  30. Cao, X., et al. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).

Tags

MacrophagePluripotent Stem CellsCell TherapyGenetic ManipulationCell CultureCell DifferentiationEmbryoid BodiesCell PassagingCell HarvestingMedia Replenishment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lopez-Yrigoyen, M., May, A., Ventura, T., Taylor, H., Fidanza, A., Cassetta, L., Pollard, J. W., Forrester, L. M. Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (158), e61038, doi:10.3791/61038 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image