미생물 공학의 ‘설계-구축 테스트’ 주기의 병목 현상은 균주의 기능적 스크린을 수행할 수 있는 속도입니다. 우리는 액적 기반 RNA 시퀀싱을 활용하는 실험당 수백에서 수천 개의 효모 세포에 적용되는 균주 스크리닝을 위한 높은 처리량 방법을 설명합니다.
효모 게놈을 편집할 수 있는 강력한 도구는 이 미생물을 엔지니어링을 위한 귀중한 플랫폼으로 만들었습니다. 수백만 개의 유전적으로 뚜렷한 균주의 라이브러리를 구성하는 것이 가능하지만 원하는 표현형을 선별하는 것은 여전히 중요한 장애물로 남아 있습니다. 기존 스크리닝 기술을 사용하면 정보 출력과 처리량 간에 장단점이 있으며, 일반적으로 관심 있는 한 제품에 대해 높은 처리량 스크리닝이 수행됩니다. 따라서, 우리는 유전자 조작 효모 긴장의 이소제성 피콜리터 식민지에 단 세포 RNA 순서를 적응해서 긴장 검열을 가속화하는 접근을 제시합니다. 효모 세포에서 RNA 시퀀싱을 수행하는 독특한 과제를 해결하기 위해 RNA 시퀀싱을 수행하기 전에 하이드로겔 및 구형 내에서 이소생효모 콜로니를 배양합니다. RNA 염기서열 분석 데이터는 효모 표현형을 추론하고 엔지니어링 된 경로를 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 당사의 방법의 확장성은 미생물 공학에서 중요한 장애물을 해결합니다.
미생물 공학의 1 차적인 목표는 귀중한화합물을생성하기 위하여 그(것)들을 유도하기 위하여 미생물을 수정하는 것입니다1,2. S. cerevisiae 때문에 배문화의 용이성과 게놈 을 엔지니어링 에 사용할 수있는 도구의 폭에 미생물 공학의 주요 유기체되었습니다3,,4,,5. 그러나, 장애물은 수정 된 효모에 기능 적인 스크린을 수행에 남아: 크기의 순서에 의해 게놈 엔지니어링 뒤에 처리량 지연을 선별. 스크리닝은 전형적으로 마이크로웰 플레이트에서 균주를 분리하고 특정 화합물6,,7의생산을 측정하여 이를 자형질화하는 것을 포함한다. 이 프로세스의 처리량은 백 마이크로리터 반응에서 개별 긴장을 비하는 데 필요한 많은 양의 시약에 의해 제한됩니다. 물방울 미세 유체학적 은 일반적으로 웰 플레이트8에서수행되는 다운 스케일링 반응에 의해 크기의 순서에 의해 효모 스크리닝의 처리량을 증가시키는 매력적인 솔루션을 제공한다. 그러나, 웰 플레이트 스크린과 마찬가지로, 액적 스크린은 전형적으로 엔지니어링된 통로9,,10,,11의글로벌 기능으로 제한된 정보를 제공하는 단일 생성물 화합물을 검출한다.
RNA 시퀀싱(RNA-seq)은 모든 관련 유전자의 발현 수준을 동시에 평가할 수 있도록 함으로써 경로 작동의 보다 포괄적인 특성화를 가능하게 할 수있다 12,,13. 또한, 액적 방법은 수천 개의 셀을 실험당 프로파일화할 수 있게 하여, 엔지니어링 된 변이체14,,15의라이브러리를 스크리는 데 필요한 처리량을 제공합니다. 그러나, RNA-seq 방법은 포유류 세포에 최적화되어; 효모는, 비교하여, 기존 방법에 의하여 그들의 순서를 배제하는16를제거하기 어려운 세포벽 및 세포벽 당 더 적은 mRNA가 있습니다. 효모 RNA-seq를 사용하도록 고처리량 액적 방법을 고안할 수 있다면 효모 엔지니어링을 위한 확장 가능하고 비용 효율적이며 정보가 풍부한 자형질 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
우리는 고처리량 액적 미세 유체학17을사용하여 효모 세포를 염기서열 분석하기 위한 우리의 최근에 개발된 방법의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 제한된 RNA의 도전을 극복하기 위해, 우리는 피콜리터 하이드로겔 구체에서 단일 효모 세포를 캡슐화하고 배양합니다. 배양은 세포를 복제하여 동일한 엔지니어링 경로를 공유하는 수백 개의 복사본을 생성합니다. 이것은 염기서열 분석에 유효한 RNA의 양을 현저하게 증가시키면서 단 하나 세포 유전자 발현 때문에 변이를 감소시킵니다. 배양 기반 증폭 후, 우리는 세포를 구형으로 하여 벌크 효소 소화를 통해 세포벽을 제거합니다. 세포막은 그대로 남아 있으므로 각 등산 식민지와 관련 mRNA가 하이드로겔 구체에 캡슐화되어 있습니다. 이를 통해 개별 콜로니를 mRNA 포획 시약 및 용해 버퍼와 페어링할 수 있으며, mRNA를 캡처, 바코드 화 및 순서화하여 Drop-Seq워크플로우 14에따라 시퀀스화할 수 있습니다. 우리의 방법은 실험 당 수천 개의 등소 성 효모 식민지의 전사체 전체 스크리닝을 허용합니다.
등소 생성 효모 콜로니 RNA 시퀀싱 (ICO-seq)에 대한 우리의 방법은 엔지니어링 효모 균주의 높은 처리량 스크리닝을 위해 게시 된 단일 세포 RNA 염기서열 분석 플랫폼 인 Drop-Seq를 적응시입니다. 효모 세포는 전형적인 포유류 세포의 mRNA 사본의 10% 미만을 함유하고 mRNA 포획16전에 분해될 필요가 있는 세포벽을 갖는다. 이 두 가지 요인은 드롭-세크 또는 다른 액적 기반 scRNA-seq 플랫폼에 효모의 직접적인 적용을 배제한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 하이드로겔 내의 단일 세포를 캡슐화하고 RNA 시퀀싱을위한 충분한 입력 물질을 제공하기 위해 콜로니로 성장시키고 용해 및 mRNA 캡처 전에 구형 세포를 생성하기 위해 효모 세포 벽을 소화합니다. 이러한 변경 사항은 원래 Drop-Seq 워크플로와 비교할 때 ICO-seq 워크플로우에 복잡성을 더하며 사용자가 원활하게 진행해야 하는 중요한 단계입니다.
장치가로즈 하이드로겔 내의 단일 효모 세포를 캡슐화하기 위해서는 장치 A의 적절한 작동이 필요합니다. 입력 효모 현탁액의 적절한 계수는 mRNA 포획 동안 합리적인 세포 포획 효율을 보장하기 위해 충분한 하이드로겔이 단일 세포를 포함하고 있음을 보장하면서 하나 이상의 효모 셀을 가진 하이드로겔의 수를 최소화하기 위해 따라야 합니다. 미세 유체 장치 작동 중에 아가로즈 겔 혼합물을 잘 용해시키고 주사기 필터를 통과하여 장치 막힘 가능성을 최소화해야 합니다. 아가로즈 젤 혼합물은 점성이 있고 단일 채널이 8개로 분할되는 지역은 특히 막히는 경향이 있습니다. 고속 카메라를 중심으로 장치의 해당 영역에서 장치 작동을 시각화함으로써 사용자는 8개 채널 각각에서 나오는 물방울의 균일성을 모니터링하고 임의의 채널에서 막힘으로 인해 균일성이 변경되면 신속하게 반응할 수 있습니다. 현미경하에서 소량의 수집된 에멀젼의 검사는 고품질 에멀젼을 확인하는 이차적인 방법을 제공한다.
하이드로겔 내 효모 콜로니의 성장에 따라 단일 콜로니 수준에서 양질의 mRNA 추출을 보장하기 위해 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 효모가 하이드로겔 배양에 있는 시간을 최적화하는 것이 중요합니다, 효모가 너무 오래 배양에 남아 있는 경우에, 많은 사람들이 RNA 순서 도중 더 높은 배경 신호로 이끌어 내고 세포 모형 사이 차별할 때 더 낮은 감도로 이끌어 내는 하이드로겔의 경계를 벗어날 것이기 때문에. Zymolyase를 사용하여 구형세포의 적당한 생성은 mRNA가 용해 완충제에 세포 노출 다음에 풀어 놓일 것이라는 점을 보장합니다. Zymolyase 다음 효 모 식민지의 육안 검사는 빛나는 효 모 세포를 얻을 한다. 부적당한 세포벽 소화는 더 낮은 RNA 포획 효율성으로 이끌어 낼 것입니다. 마지막으로, 하이드로겔은 장치 B에 주입될 때 클로즈팩되어야 합니다.
우리의 방법에 대한 잠재적 인 관심사는 효모의 마이크로 겔 문화가 유전자 발현을 크게 바꿀 수 있다는 것입니다. 마이크로겔과 한천에서 효모 유전자 발현을 조사하는 이전 연구는 유전자 발현 평균의 차이를 보여 주지만 전반적으로 긍정적 인 상관 관계17,다양한 효모 균주에 대한이 주장에 대한 추가 조사는 신중하지만. 이 방법은 또한 푸아송 통계14에따른 mRNA 포획 비드의 스토크로 인해 세포 포획 효율이 제한적이다. 현재 약 10%의 방울이 비드와 콜로니를 함유하고 있으며, 이중 캡슐화율은 1% 미만일 것으로 예상됩니다. 이중 캡슐화는 RNA-seq 데이터 분석 중에 혼란스러운 요소로 이어지고 필터링은 여전히 도전적인23; 25%의 캡처율은 이중 캡슐화의 상응하는 증가로 이어질것입니다(보충 그림 2). Drop-Seq 플랫폼을 사용하여 ICO-seq를 입증하지만, mRNA 포획 비드를 통계적으로 보다 결정적으로 도입하는 다른 액적 RNA-seq 플랫폼이 있는데, 예를 들어 시판되는 10x 유전체학 크롬 플랫폼15,,24. 이러한 플랫폼을 ICO-seq와 통합하면 푸아송 통계가 허용하는 것 이상으로 캡처 효율성을 높일 수 있습니다. 마지막으로, 액적 RNA-seq의 근본적인 한계는 시퀀싱 후 관심 있는 세포를 복구할 수 없다는 것입니다. 이 방법을 사용하여 분석할 효모 라이브러리의 유형을 고려할 때 이러한 제한을 고려해야 합니다.
대장균 E. coli25 및 S와같은 미생물에 대한 클론 수준에서 세포 간 이질성이 입증되었습니다. cerevisiae26은 대량 수준 분석이 그렇지 않으면 마스크 할 것이라는 새로운 세포를 밝히는. C. albicans에 수행된 대량 RNA-seq 분석은 인구 전체 전사체 변경을 보는 경향이 있습니다, 또는2개의별개의 인구로 백색 및 불투명 한 세포27,28. ICO-seq의 적용은 추가 하위 상태의 발견으로 이어질 수 있으며 다른 효모 종 내에서 새로운 세포 상태를 발견하기위한 분석 프레임 워크를 제공 할 수 있습니다. 그러나, 하이드로겔 내세포의 성장은 효모에 한정되지 않는다:포유동물, 세균, 및 기타 곰팡이 세포와 같은 다른 세포 유형은 또한 하이드로겔29,,30내에서 경작될 수 있다. 단일 세포 대 등소원 콜로니의 시퀀싱은 세포 간 변이로 인한 생물학적 잡음의 평균화로 이어져 세포 유형 간의 차별을 개선합니다. 이것은 유전 다양성이 특정 합성 통로에 센터 세포를 분석할 때 도움이 될 수 있습니다. ICO-seq에 대한 세포 유형 입력의 확장 된 가능성과 상업적으로 이용 가능한 액적 RNA-seq 플랫폼과의 잠재적 인 통합은 유전 수준에서 세포 이질성을 해부하기위한 유망한 플랫폼으로 ICO-seq를 배치합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 국립 과학 재단 경력 상 DBI-1253293, 국립 보건 원 새로운 혁신상 DP2AR068129 및 R01HG008978, 국립 과학 재단 기술 센터 보조금 DBI-1548297, 그리고 세포 건설을위한 UCSF 센터에 의해 지원되었다. ARA와 ZJG는 찬 – 주커 버그 바이오 허브 조사자입니다.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |