Summary

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

Published: May 07, 2020
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Summary

我々は、頭蓋骨に安定させることができる先端に曲がった針を採用するインタセラセナーナル注射を記述し、したがって、基礎となるパレンチマへの損傷のリスクを排除する。このアプローチは、レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングおよび操作や脳脊髄液の動きを追跡するために使用することができます。

Abstract

ここで概説するプロトコルは、基礎となるパンキチマへの損傷のリスクを排除しながら、水槽マグナを介して溶液を安全かつ手動で注入する方法を説明しています。以前に公開されたプロトコルは、硬膜表面から最大1〜2mmに下げる必要があるストレート針を使用することをお勧めします。硬膜が穿刺されると、抵抗の急激な低下は、針を安定した位置に維持することが困難になります。私たちの方法は、代わりに、頭蓋骨の後頭部骨に対して安定させることができる先端に曲がった針を使用し、したがって、注射器が硬膜の穿孔後に組織に浸透するのを防ぎます。手順は、簡単で再現性があり、操作された動物に長続きする不快感を引き起こすものではありません。我々は、血管レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングの文脈におけるインタセラセナーナル注射戦略について述べている。さらに、神経発達におけるレプトメニンの役割の調査や細菌性髄膜炎の蔓延など、これらの現象に関連する遺伝子の遺伝的切開を通じて、幅広い研究課題に取り組むためにも利用できる。さらに、この手順は、一定の送達のための自動注入システムと組み合わせることができ、蛍光標識された分子の注入を介して脳脊髄液の動きを追跡するために使用される。

Introduction

レプトメニンゲ細胞は、脳を重ねた薄層に組織化された線維芽細胞様集団であり、コラーゲン架橋に関与する遺伝子(例えばDcnおよびLum)を発現し、脳髄膜バリア(例えばCldn11)1、2の確立に1,含まれる。レプトメニンゲ細胞は、脳脊髄液排液3の厳密な制御から、発達中の脳44,55における神経前駆細胞の指導まで、幅広い生理機能に関与している。最近の研究では、新生児のレプトメニンジが脳のパレンチマに移行し、機能的皮質ニューロン6に発展する放射状グリア様細胞を収容する可能性が提案されている。

レプトメニンゲ細胞は、表面アストロサイトに近接して位置し、それらと共有し、ならびに他の層状アストロリア、コネキシン-30(Cx30)7の発現を共有する。7以下に概説する外科的処置は、Cx30+細胞中のtdTomatoを条件付きで発現するトランスジェニックマウスのシスターナマグナへのエンドキシフェンの1回の送達を介して、これらの髄膜細胞の広範かつ+特異的な標識を可能にする(すなわち、運命マッピングのためのCreER-loxPシステムを使用する)。エンドキシフェンはタモキシフェンの活性代謝産物であり、タモキシフェンと同じ方法でCreER発現細胞の再結合を誘導する。しかし、高濃度のエタノールの代わりに5〜10%のDMSOに溶解するため、局所適用に推奨される溶液である。さらに、エンドキシフェンは脳・髄膜バリアを越えず、それにより、基になるCx30+占星団集団の標識なしにレプトメニンゲザル細胞の特異的な組換えを可能にする(代表結果を参照)。

ここで提示される技術は、水槽のマグナへの直接アクセスを介して、手動で安全に脳脊髄液中の化合物を注入することを目的としています。頭蓋骨切除術を必要とする他のより侵襲的な手順とは異なり、このアプローチは、頭蓋骨または脳の気質に損傷を与えることなく化合物を注入することを可能にする。したがって、実質グリア細胞の活性化によって引き起こされる炎症反応の誘導とは関連しない。,88、9、109の前に記載された他の注射戦略と同様に、本アプローチは、頸部筋肉を重ね合わせた鈍解の後、システルナマグナを覆うアトラント後頭膜の外科的暴露に依存する。10しかし、他の手順とは異なり、投与中に後頭骨に対して安定化することができる先端に曲がった針の使用をお勧めします。これは、針があまりにも深く貫通し、基礎となる小脳と髄質を損傷するリスクを防ぎます。

この外科的処置は、細胞の同一性およびペラキマル層を通る移動経路の変化をマッピングすることを目的とする系統追跡調査と互換性がある。また、皮質の発達寄与する細胞や細菌性髄膜炎,3,11の広がりなど、健康や疾患におけるレプトメニンゲ細胞の役割を調査しようとする遺伝子アブレーション研究にも適応することができる。3最後に、野生動物の蛍光トレーサーの送達と組み合わせると、脳脊髄液の動きを追跡するために利用することができる。

Protocol

ここに提示された外科的処置は、ストックホルム・ノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムントによって承認され、研究所(スウェーデンのカロリンスカ研究所)が提供する仕様に同意して実施された。 注:インタシターナル注射は、複数の研究目的に柔軟に適応することができる。R26R-tdTomato12およびCreERを担うトランスジェニックマウスラ?…

Representative Results

Cx30プロモーター13と誘導蛍光レポーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタシビサーナル注射は、皮質中の隣接するCx30発現表面およびパレンキカルアストロサイトに標識することなく、レプトメニンゲン細胞の特異的な組み換えを可能にする(図1)。システルナマグナへのアクセ?…

Discussion

ここで概説するプロトコルは、運命マッピングのためにレプトメニンゲ細胞にラベルを付ける簡単で再現可能な手順を示しています。我々は、Cx30-CreERでtdTomato蛍光レポーターの発現を誘導するために、タモキシフェンの活性代謝産物であるエンドキシフェンのインタセラシサーナル注射を使用する。R26R-tdトマトマウス12,,13.

シ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌学会、スウェーデン戦略研究財団、クヌート・オーク・アリス・ワレンベルス・スティフタース、カロリンスカ研究所(StratRegen)の幹細胞と再生医療の戦略研究プログラムからの助成金によって支えられました。

Materials

Anesthesia unit Univentor 410 8323102 Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane) Baxter Medical AB 000890
Betadine Sigma-Aldrich PVP1
Carprofen Orion Pharma AB 014920 Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue Carl Roth 0258.1 Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue Stoelting 50479
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Endoxifen Sigma-Aldrich E8284
Ethanol 70% Histolab 01370
Hamilton syringe (30G beveled needle) Hamilton 80300
Lidocaine Aspen Nordic 520455
Mouse head holder Narishige International SGM-4 With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors Fine Science Tools 15009-08
Shaver Aesculap GT420
Sterile absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator World Precision Instrument 501897
Tweezers Dumont 11251-35
Viscotears Bausch&Lomb Nordic AB 541760

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Zamboni, M., Santopolo, G., Frisén, J. Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection. J. Vis. Exp. (159), e61009, doi:10.3791/61009 (2020).

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