Bademcikler Mononükleer Hücrelerin İzolasyon Ex Vivo Doğuştan Gelen Bağışıklık Yanıtları Bir İnsan Mukozal Lenfoid Doku Çalışma
Summary
Bu protokolde, kısmi cerrahi tonsillektomi uygulanan sağlıklı insanlardan bademcikler mononükleer hücrelerin invazyon asyonunu inceleyip mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebileceğimizi açıklıyoruz.
Abstract
Mukoza ile ilişkili lenfoid dokulardan izole hücrelerin incelenmesi (MALT) mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde bağışıklık hücrelerinin yanıtının anlaşılmasını sağlar, çünkü dokudaki konak-patojen etkileşimleri modelleyebilirler. Dokulardan elde edilen izole hücreler ilk hücre kültürü modeli iken, doku elde etmek zor olabilir, çünkü bunların kullanımı ihmal edilmiştir. Bu protokolde, sağlıklı insan bademciklerinden bademcikteknükleer hücrelerinin (TMC) aktivasyon üzerine doğuştan gelen immün yanıtları incelemek ve mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebildiğini açıklıyoruz. Bademciklerden TMC’lerin izolasyonu hızlıdır, çünkü bademciklerde ancak epitel vardır ve milyarlarca büyük bağışıklık hücresi tipine kadar verim verir. Bu yöntem, kandan periferik mononükleer hücrelerin (PBMCs) kullanımına benzer immünoassays, qPCR, mikroskopi, akış sitometrisi, vb. gibi çeşitli teknikler kullanılarak sitokin üretiminin saptanmasını sağlar. Ayrıca, TMC’ler uyuşturucu testine, gelecekteki toksisite testleri için dikkate alınması gereken PBMC’lere göre daha yüksek bir duyarlılık göstermektedir. Böylece ex vivo TMC kültürleri kolay ve erişilebilir bir mukozal modeldir.
Introduction
İnsan organları üzerinde yapılan çalışmalar erişilebilirliğin yanı sıra bariz etik nedenlerle de kısıtlanmıştır. Ancak, insan biyolojisinin karmaşıklığını tam olarak anlamak için gereklidirler. İzole hücrelerin kültürleri (birincil kültürler veya hücre çizgileri) hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılabilirlikleri nedeniyle standart bir sistemdir. İzole hücre kültürleri olağanüstü keşifler izin vermiş olsa da, onlar tam in vivo organ biyolojisi taklit etmez çünkü hücre hatlarının kullanımı daha yakından inceleme üzerine geldi. Ancak, üç boyutlu hücre veya doku eksbitki kültürü son derece karmaşık4,5,6. Gerçekten de, doku veya organ parçası son derece heterojendir çünkü hücre bileşimi dokudaki lokalizasyona bağlı olarak farklılık gösterir. Böylece, doku blokları kullanarak birçok teknik ve biyolojik çoğaltmalar analizi gerektirir, donör veya hastaların çok sayıda ihtiyaç yol açan.
Mukoza ile ilişkili lenfoid dokular (MALT) yapısal lenf düğümleri benzer ama benzersiz işlevleri var, ana rolü mukozal bağışıklık düzenlemek için çünkü7. Genellikle dokulardan bazı mesafelerde bulunan lenf düğümleri aksine, MALT genellikle mukozal doku epitel hemen altında yer almaktadır. Histolojik olarak, çoğunlukla B ve T hücrelerinin yüksek konsantrasyonlarda oluşur, ama aynı zamanda makrofajlar ve dendritik hücreler gibi antijen sunan hücreler. MALT insan vücudundaki lenfoid dokunun yaklaşık% 50’sini oluşturmaktadır. MALT konumlarına bağlı olarak dokuz gruba ayrılır: GALT (gut-), BALT (bronş-), NALT (nazal-), CALT (konjonktiva), LALT (gırtlak-), SALT (cilt-), VALT (vulvo-), O-MALT (organize) ve D-MALT (diffüz). O-MALT esas olarak Waldeyer bademcikhalka bademcikoluşur ve en erişilebilir MALT8,9. Nitekim, orofarenks bulunan bademcikler (potansiyel) invaziv mikroorganizmalar10 sindirim ve solunum10yollarını koruyan önemli bir bariyer oluşturmaktadır. Buna ek olarak, bademcikler ince tabakalı skuamöz olmayan keratinizing epitel ile kaplıdır, kan damarları içeren bağ dokusu bir kapsül tarafından desteklenen, sinirler, ve lenfatikler, bağışıklık hücrelerine kolay erişim sağlayan11,12. Ayrıca bademciklerin giderilmesinde yapılan cerrahi işlem olan tonsillektomi, uyku bozukluğu olan çocuklarda yapılan ve bademciklerin fizyolojik ortamlarda kolayca bulunabilen doku13’ü haline getiren yaygın bir işlemdir.
Bademcikler mukozal bağışıklık içeren patolojilerde immün hücre yanıtının incelenmesine olanak sağlar. Gerçekten de, HIV enfeksiyonu, bademcikler bağışıklık hücrelerinin yüksek konsantrasyonoluşur çünkü, onlar viral çoğaltma ana hedefi ama aynı zamanda dolaşımda tespit edilmez sitokinler büyük miktarda üretmek14,15. Sabit hallerde, doğuştan benzeri hücrelerin nadir popülasyonları bademcikler de dahil olmak üzere çeşitli mukozal dokularda mevcuttur, ancak aslında kan yok.
Bu nedenle bademciklerden (TMC) gelen mononükleer hücreler PBMC’lere göre daha alakalı ve karmaşık bir modeldir ve daha derin sorulara cevap verebilir. Öte yandan, doku eksbitkilerinin kullanımı karmaşık olabilir ve her zaman doğuştan gelen bağışıklık çalışmaları ile ilgili değildir. Böylece, TMCs16kullanarak mukozal immün aktivasyon çalışması için bir model oluşturdu. Burada TMC’lerin taze insan bademciklerinden verimli bir şekilde izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ex vivo çalışmalar için bütünlüğünü koruyarak bağışıklık hücrelerinin çok sayıda kurtarma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan bademcikleri mukozal arayüzde doğuştan gelen immün yanıtları incelemek için bütünleştirici ve fizyolojik ex vivo modeli temsil eder, çünkü ikincil lenfoid organın rolünü taklit ederler. İlginçtir ki, TMCs hücresel bileşimi PBMCs benzer ve tüm büyük hücre popülasyonları içerir, onların yüzdesi kandan PBMCs farklı olabilir rağmen(Şekil 1). Ek popülasyonlar da bulunabilir, tüm bağışıklık yanıtları dokularda başlatılır gibi (mukoza veya sekonder…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P) tarafından desteklendi. H) deneyler ve N.B. bursu için (AAP 2017 166). N.S., ANRS’den burs (AAP 2016 1), Avrupa Moleküler Biyoloji Örgütü EMBO for Fellowship (LT 834 2017), Ulm Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıp Fakültesi ‘Baustein” ve Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1 1) için ANRS’den destek kabul eder.
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
Riferimenti
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
