Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

1. Préparation des médias de croissance Pour les recettes moyennes de croissance exactes pour ce protocole, veuillez vous référer au tableau 1. Pour préparer 1 L de support, placez un bécher de 2 L sur une plaque à remuer et placez une barre à remuer à l’intérieur. Remplir le bécher de 900 ml d’eau distillée et allumer la plaque à remuer. La barre d’agitation doit tourner à vitesse moyenne. Peser tous les ingrédients en poudre et dissoudre dans un bécher. Mesurer tous les ingrédients liquides, le cas échéant, et ajouter au bécher. Porter le volume final à 1 L à l’aide d’eau distillée. Mesurez le pH et ajustez-les aux spécifications de la recette. Si vous formulez un milieu de croissance liquide, aucune gélose n’est ajoutée. Fixez un stérilisateur de filtre à une pompe à vide et versez le milieu de croissance liquide à travers le filtre. Allumez la pompe et attendez que tout le liquide soit tiré à travers. Placez un bouchon sur le contenant et attachez une étiquette. Si vous formulez un milieu de croissance solide, après l’ajustement du pH, ajouter l’agar directement dans une bouteille ou une fiole. Verser le milieu de croissance liquide de 1 L dans un flacon Erlenmeyer de 2 L, ou le diviser en deux bouteilles automatiques de 1 L (500 ml chacune). Si deux bouteilles sont utilisées, diviser l’agar et l’ajouter directement aux bouteilles. Couvrir le flacon d’un couvercle respirant, comme deux couches de papier d’aluminium, pour permettre à la vapeur de s’échapper. Si vous utilisez une bouteille, bouchonner lâchement le couvercle de vis sur le dessus. Autoclave à 121 oC pendant 25 min. Après l’autoclacage, retirer le milieu de croissance de l’autoclave et laisser refroidir jusqu’à 55-60 oC (un bain d’eau réglé à 55 oC peut faciliter les choses). Maintenir le milieu de croissance à l’état liquide pendant quelques heures jusqu’à ce qu’il soit pratique de verser les assiettes. Une fois refroidis, ajouter tous les additifs post-stérilisation (voir tableau 1) et bien mélanger. Après l’ajout de tous les ingrédients, versez le volume désigné dans le contenant de choix dans une hotte à débit laminaire. Le milieu de croissance peut être versé dans les plats Petri désirés manuellement ou à l’aide d’un appareil de distribution liquide. Lors de la coulée manuelle, il est recommandé de transférer un grand volume de milieu autoclaved dans un plus petit bécher stérile (500 ml) pour faciliter la manipulation. Laisser refroidir le milieu de croissance et se solidifier. Le milieu de croissance sera disponible pour une fois de plus en plus solide et est mieux utilisé le lendemain après le séchage légèrement pendant la nuit dans un capot à débit stérile comme des piles de plaques à couvercle. Après le séchage de nuit, transférer les assiettes dans des manches en plastique, plier sur l’extrémité lâche, et le garder en place avec un petit peu de ruban adhésif. Cela évite un séchage excessif. Le milieu peut être stocké dans un environnement frais, sombre et propre (4-16 oC) jusqu’à 1 mois. 2. Cultiver des plantes donneuses et récolter des oreilles immatures Cultivez tout maïs accessible au public consanguin (c.-à-d. B73, Mo17 ou W22) dans une serre dans des pots de 1,5 gallon (5,9 L) contenant un substrat sans sol. Utilisez une période de photos de 16/8 (jour/nuit), avec des températures moyennes de 25,5 oC pendant la journée et de 20 oC la nuit. Les plantes sont arrosées au besoin et fertilisées à l’arme à feu à l’eau à l’eau (N-P-K de 15-9-12), qui peuvent être incorporées dans le mélange du sol ou ajoutées à la surface après la plantation. Il faut habituellement environ 70-90 jours après la germination des graines pour les oreilles à émerger. Lorsque les pousses d’oreilles émergent, couvrez-les d’un sac de pousse pour éviter que la pollinisation incontrôlée ne se produise. Environ 2-3 jours après l’apparition des soies et si le pollen sera disponible le lendemain, couper les soies à l’aide de ciseaux qui ont été stérilisés dans 70% d’éthanol. Couper les soies et l’enveloppe à environ 2,5 cm au-dessous de l’extrémité des feuilles d’enveloppe, où les soies émergent. La pollinisation peut être effectuée le lendemain. Assurez-vous de rester ilize ciseaux entre chaque oreille. Une fois que les anthèques sortent d’un gland, recouvrez le gland d’un sac de gland et d’un trombone non désilié à la base du sac autour de la tige. Le lendemain matin, pliez doucement la plante et appuyez sur le sac pour encourager le pollen à être libéré. Retirer le sac de gland et plier le dessus du sac pour empêcher le pollen de s’échapper. Il est généralement préférable de sac le gland 1 jour avant qu’il ne soit utilisé (pour éviter l’accumulation de pollen mort et les anthères hangar). Le pollen frais peut être prélevé dans les glands pendant environ 3-5 jours. Lorsque les anthères émergent des fleurons intérieurs à la base du gland, ce gland ne produira probablement pas de pollen viable le lendemain. Utilisez le pollen de la même plante (auto-autodisation) ou d’une autre plante de la même consanguinité (sibbing). Retirez le sac d’oreilles ou coupez l’extrémité du sac pour exposer les soies, puis versez rapidement le pollen du sac de gland sur les soies. Couvrez l’oreille avec le sac de gland immédiatement et agrafez la base du sac autour de la tige pour la fixer. Il peut être utile d’isoler physiquement la plante des plantes à fleurs de différents génotypes pendant la pollinisation pour aider à prévenir la pollinisation croisée. Laissez le sac de gland sur l’oreille jusqu’à ce que l’oreille immature soit prête à récolter. 9-12 jours après la pollinisation, dépistez les oreilles pour la taille de l’embryon. Faites glisser le sac de pollinisation vers le haut de la tige pour exposer l’oreille. Tirez doucement l’enveloppe vers le bas pour exposer les grains sur environ un tiers à un quart de la circonférence de l’oreille et environ un tiers de la distance en bas de l’oreille. Les grains près de la pointe ne seront pas représentatifs de la taille moyenne de l’embryon. À l’aide d’un scalpel, couper le bouchon d’un seul grain qui semble semblable à la majorité des autres grains de taille et de couleur. Utilisez une spatule (avec une règle) pour enlever l’embryon tel que décrit à l’étape 4.6. Mesurez la longueur de l’embryon à l’aide d’une règle intégrée sur la spatule ou d’un étrier numérique. Si l’embryon est entre 1,5 et 2,0 mm, récoltez l’oreille. S’il s’agit d’un mois d’heure de 1,3 mm, l’oreille peut être prête à être récoltée plus tard dans la journée et peut être vérifiée à nouveau dans environ 7-8 h. 3. Préparation de la culture de suspension d’Agrobacterium pour l’infection REMARQUE : La souche D’Agrobacterium LBA4404 (Thy-) contenant phP81430 (figure 1) et PHP7153912 est stockée sous forme de stock de glycérol à -80 oC. Ces documents peuvent être obtenus auprès de Corteva Agriscience dans le cadre d’un accord de transfert de matériel. LBA4404 (Thy-) est une souche auxotrophique qui a besoin de thymidine fourni dans les médias de croissance. L’utilité principale de la souche auxotrophe Agro est à des fins de biocontenu. Il a l’avantage supplémentaire de réduire la surcroissance agro. La souche auxotrophique Agro ne pousse pas sans thymidine supplémentaire. Néanmoins, la thymidine peut (vraisemblablement) être fournie par le tissu végétal mourant dans la culture. Par conséquent, il est encore nécessaire de fournir un antibiotique dans le milieu pour contrôler complètement l’agro auxotrophique. Cependant, il sera plus facile à contrôler en raison de la croissance compromise de la souche auxotrophique en l’absence de thymidine. Quatre jours avant la date de l’infection, initier une plaque “mère” du stock de glycérol en stries les bactéries sur une plaque YP avec 50 mg/L de thymidine, 50 mg/L de gentamicin, et 50 mg/L de spectinomycine (tableau 1). Incuber l’assiette « mère » dans un incubateur de 20 oC pendant 3 jours. Un jour avant l’expérience d’infection, préparez une plaque « de travail » en sélectionnant une à cinq colonies de la plaque « mère » et en striant les bactéries de la plaque « mère » à une nouvelle plaque de PJ (avec de la thymidine, de la gentamycine et de la spectinomycine; Tableau 1). Sillonnez la plaque quotidienne de « travail » dans des quadrants séquentiels et exécutez la boucle 1x à travers la zone juste rayée dans le quadrant successif, répétant pour former des quadrants qui ont été dilués en série. Incuber la plaque “travailler” pendant la nuit dans un incubateur de 27 oC. Après avoir terminé la dissection de l’embryon (étape 4.8), utilisez une boucle ou un outil similaire pour recueillir l’agrobactérie dans une région de la plaque « de travail » où la croissance bactérienne est visible sous forme de fines stries de colonies.REMARQUE : Évitez les zones de la plaque avec une pelouse dense de croissance bactérienne. La croissance de l’Agrobacterium a probablement déjà commencé à diminuer dans les zones denses, tandis que dans les zones avec des colonies visibles, les bactéries sont dans la phase de croissance appropriée pour l’infection. Suspendre les bactéries collectées dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de milieu liquide 700A (tableau 1). Vortex de suspendre complètement la culture des bactéries. Mesurer la densité optique à une longueur d’onde de 550 nm. Ajustez le volume jusqu’à ce que l’OD se situe entre 0,35-0,45, 0,4 étant la valeur optimale.REMARQUE: Si l’OD est supérieur à 0,45, ajouter plus de 700A milieu liquide. Si l’OD est inférieure à 0,35, inoculer plus de colonies d’agrodans la culture de suspension. 4. Dissection d’embryon, infection, et co-culture Sélectionnez des oreilles appropriées pour les expériences de transformation; ceux-ci devraient avoir un bon ensemble de graine et avoir des embryons qui vont dans la taille de 1.5-2.0 mm. Ils sont généralement récoltés entre 9-12 jours après la pollinisation. Les oreilles récoltées peuvent être utilisées fraîches ou entreposées pendant 1 à 4 jours à 4 oC, bien que la qualité de la réponse se dégradera probablement progressivement avec un stockage prolongé au-delà du premier jour. Retirer les cosses et les soies. Insérer une poignée dans la base ou le haut de l’oreille. La poignée peut être une paire de forceps, tournevis, etc. Placer les oreilles dans un grand récipient (p. ex., un bécher de 2 L avec la poignée vers le haut, remplir le récipient d’une solution de désinfection. La solution de désinfection est 1,8 L de 20% d’eau de Javel commerciale (1,65% d’hypochlorite de sodium) et quelques gouttes de surfactant Tween 20. Stériliser les oreilles à l’intérieur d’un banc à débit laminaire. Après 20 min, vider la solution d’eau de Javel et rincer les oreilles 3x (5 min chacune) à l’aide d’une généreuse quantité d’eau distillée stérile. Retirer l’eau et laisser sécher les oreilles pendant plusieurs minutes.REMARQUE : Il est important que les oreilles soient complètement immergées dans la solution d’eau de Javel pendant 20 min. Déplacez les oreilles soigneusement autour dans la solution d’eau de Javel de temps en temps pour déloger des bulles d’air. Préparer un tube microcentrifuge de 2 ml rempli de 700A milieu liquide. Ce tube sera utilisé pour recueillir les embryons immatures. Prenez l’oreille et à l’aide d’un scalpel stérile, enlever le haut 1-2 mm des couronnes de noyau pour exposer l’endosperme. Utilisez une micro spatule pour enlever l’embryon zygotique immature (IZE). L’IZE sera situé dans le noyau, sur le côté face à la pointe de l’oreille, et près de l’attachement à l’esquif. À l’aide de la spatule, insérez-la dans l’endosperme dans le péricarpe le plus éloigné de l’embryon, puis tordez doucement vers le haut pour déloger l’endosperme et permettre l’ablation de l’embryon (Figure 2). À l’aide de la spatule, transférer l’embryon dans le tube contenant le milieu liquide 700A. Continuez jusqu’à ce que jusqu’à 100 embryons aient été recueillis. Plusieurs tubes peuvent être remplis (100 embryons/tube) avant de passer à l’étape suivante. À ce stade, la suspension d’Agrobacterium doit être préparée (voir l’étape 3.5). Retirer le milieu liquide 700A du tube embryonnaire à l’huile de 1 ml. Ajouter le milieu 700A frais pour laver les embryons, puis retirer ce milieu ainsi. Ajouter 1 ml de suspension Agrobacterium et vortex sur un réglage bas (3/10) pour 30 s ou tube inverti 12x-15x à mélanger. Laisser reposer ce tube horizontalement sur le banc pendant 5 min. Après 5 min, transférer le tube entier des embryons et la suspension D’Agrobacterium sur une plaque de 562V milieu de co-culture (tableau 1). Ceci peut être réalisé en plaçant la plaque sur le banc et en versant rapidement le contenu du tube sur la plaque. Faites tourbillonner doucement la plaque pour distribuer les embryons et retirez la suspension De l’Agrobacterium à l’aide d’une pipette de 1 ml. Assurez-vous que les embryons sont placés avec le côté scutellum (rond) vers le haut. Utilisez une loupe ou une lunette de dissection, si nécessaire. Placer les assiettes dans des boîtes en plastique (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) et les couver pendant la nuit de 16 à 18 h à 21 oC dans l’obscurité. Aucun emballage de plaque individuel à l’aide de film de paraffine ou de ruban d’évent n’est nécessaire. Après la co-culture de nuit, déplacez les embryons infectés, côté scutellum vers le haut, sur le milieu de repos 605T (tableau 1). Placer environ 30 embryons par assiette. Incuber les plaques à 26-28 oC dans l’obscurité. Incuber pendant 4-10 jours (7 jours est préféré). À l’heure actuelle, le développement d’embryons somatiques peut être observé à la surface du scutellum zygotique (figure 3). 5. Sélection, traitement thermique et régénération Après la période de repos, la chaleur choque les embryons. Placer la boîte contenant les plaques d’embryons dans un incubateur de 45 oC avec une humidité relative de 70 % pendant 2 h. Ensuite, retirez la boîte de l’incubateur de 45 oC et placez-la dans l’incubateur sombre de 26 à 28 oC pendant 1 à 2 h.REMARQUE : Si vous n’arrivez pas à atteindre 70 % d’humidité dans un incubateur, ajoutez une double couche de serviettes en papier autoclaveautoauto-clés au fond de la boîte et trempez-laisser de l’eau autoclaved pour maintenir l’humidité dans la boîte. Remettre les assiettes dans la boîte sur le dessus des essuie-tout et sceller le couvercle avant de les placer à 45 oC. Utilisez un petit hygromètre/thermomètre numérique pour surveiller la température et l’humidité. Transférer les EBE traitées à la chaleur du milieu de repos au milieu de formation de pousses (13329A) contenant 0,05 mg/L d’imazapyr en tant qu’agent sélectif (tableau 1). Lors du transfert, retirer les coleoptiles, s’il est présent, à l’aide de forceps à pointe fine ou de ciseaux chirurgicaux. Placez de 10 à 15 embryons par assiette pour éviter la surpopulation. Gardez les embryons dans ce milieu pendant 2 semaines dans l’incubateur sombre de 26 oC. Transférer les embryons au milieu d’enracinement (13158; Tableau 1) pendant 1-2 semaines. Placer autour de huit pièces par assiette et incuber dans une salle lumineuse ou une chambre légère(16 jours/8 nuit, 20-150 ‘mol/m 2/s) à 27 oC. Au fur et à mesure que les plantules se développent, placez des plantules plus fortes contenant à la fois des pousses et des racines vigoureuses sur de nouvelles plaques de milieu d’enracinement, placez une plante par assiette. Cela permettra une croissance plus forte des plantets. Placez les assiettes dans la salle lumineuse ou la chambre lumineuse pendant encore 7-14 jours.REMARQUE : Retirez soigneusement les morceaux de callus associés au plantet pour vous assurer qu’il est en bon contact avec le milieu. Au fur et à mesure que la plante devient plus vigoureuse, retirer la plante du milieu d’enracinement et rincer les racines à l’eau du robinet pour enlever l’agar. Transplanter des plantes individuelles dans des pots de 3 sur2 (19 cm2)contenant un substrat sans sol pré-humide. Placer les pots dans un plateau (27 cm x 54 cm) avec des trous de vidange et recouvrir le plat d’un dôme d’humidité plastique. Cette étape d’acclimatation peut être réalisée soit dans la chambre de croissance ou dans la serre chaude avec des conditions de croissance décrites dans la section 2 (étape 2.1) ci-dessus. 6. Transplantation à la serre et la production de graines T1 Vérifier les plantes 2x par jour. De l’eau au besoin. Assurez-vous que les plantes ne sont ni séchées ni surarroisées. Le maintien d’un substrat légèrement sec favorise la croissance des racines.REMARQUE : Le dôme d’humidité peut être enlevé 4-7 jours après la transplantation. Les plantes doivent être cultivées dans ces petits pots jusqu’à ce qu’elles se soient visiblement remises du stress de la transplantation dans le sol. Cela devrait prendre environ 9-14 jours. Transplanter l’ensemble du bouchon sans sol et le plantlet dans un pot de 1,5 gal (5,9 L). Maintenir dans la serre chaude et l’eau quand le sol se sent sec au toucher. Ajouter un engrais à libération contrôlée avec du N-P-K de 15-9-12 dans le pot, qui peut être soit incorporé dans le mélange de substrat ou appliqué à la surface. Lorsque les pousses d’oreilles commencent à émerger de la plante, utilisez un sac de pousse s’apaise pour couvrir les pousses d’oreilles. Assurez-vous d’utiliser un sac semi-transparent afin que les soies émergentes puissent être observées sans enlever le sac. Le sac de pousse permet une pollinisation contrôlée. Il est important de toujours sac glands transgéniques. Après l’émergence des soies (1-2 jours), coupez les soies émergées à une longueur uniforme. Ce sera environ 2,5 cm au-dessous du dessus des feuilles d’enveloppe. Utilisez une paire de ciseaux propres qui ont été stérilisés dans 70% d’éthanol. En coupant les soies, une touffe uniforme se développe le lendemain pour que la pollinisation se produise. Pour la majorité des génotypes de maïs, le temps optimal pour la pollinisation est de 2-3 jours après l’émergence du gland ou de la soie. Recueillir le pollen de la même plante (si elle est auto-pollinisée) ou d’un type sauvage de la même consanguinité (si croisement ou croisement). Recueillir le pollen dans un sac de gland et l’appliquer sur la touffe de soie de la plante T0. Si le pollen provient d’une plante sauvage (non transgénique), placez le pollen dans un sac de gland brun nature. Si le pollen provient d’une plante transgénique, placez le pollen dans un sac à rayures vertes pour indiquer que le pollen est transgénique. Suivez les étapes 2.5-2.10 pour plus de détails sur la pollinisation. Environ 2 semaines après la pollinisation, retirer les sacs de gland des oreilles et permettre le séchage pour commencer. Pour aider à sécher, cessez d’arroser la plante 21-25 jours après la pollinisation. Vous pouvez également retirer les feuilles d’enveloppe pour exposer la graine. Cette pratique aide également à prévenir la moisissure. Environ 45 jours après la pollinisation, récoltez les graines et entreposez-les à froid entre 4 et 12 oC.